土壤中纖維素降解菌的篩選鑒定及其糖化水平

張海艷，路青青，楊偉平

(洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934)

纖維素資源是地球上最豐富和廉價的可再生資源，包括農作物秸稈、園林廢棄物、甘蔗渣及工業纖維廢渣等[1]。全世界通過光合作用產生的纖維素估計為1.55×109t/a，其中約89%尚未被利用[2]。我國的纖維素資源豐富，數量巨大，但由于纖維素難以降解，所以目前對其開發和利用非常有限，主要用于燃料、畜牧飼料與積肥，導致纖維素資源利用率很低，且造成環境污染[1-4]。產纖維素酶的微生物可將天然纖維素分解為葡萄糖等可利用的物質，對解決污染、能源危機等問題，保障人類社會可持續發展具有重大意義[5-6]。因此，篩選產高活性纖維素酶的菌株，是開發利用纖維素資源的前提和關鍵。產纖維素酶微生物廣泛存在于土壤、極地海洋、溫泉、植物組織、動物體內及真菌等生物樣品和環境中，其中，土壤中纖維素分解菌最多[7-8]。何楠等[9-16]對不同土壤中纖維素降解菌進行分離、鑒定，并對其產酶活性進行研究；周晨妍等[17-18]對產纖維素酶菌株發酵條件進行優化研究。

為了提高纖維資源的有效利用，開發纖維素降解菌劑，采用剛果紅染色法從河南省欒川縣龍峪灣森林公園腐殖質土樣中分離篩選產纖維素酶菌株，經16S rRNA分子鑒定后，對其糖化水平和產酶活力進行研究，旨在為豐富降解纖維素微生物資源，更好地利用纖維素資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集 從龍峪灣國家森林公園采集腐殖土樣，4℃保存備用。

1.1.2 主要試劑 3，5-二硝基水楊酸、重蒸酚、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸及檸檬酸鈉等。

1.1.3 培養基 羧甲基纖維素(CMC)培養基、LB培養基、產酶培養基、濾紙條培養基，均參照文獻[10，19]配制。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 將土壤樣品按10-6～10-2梯度用無菌蒸餾水稀釋備用。

1.2.2 纖維素降解菌的分離篩選

1)初篩。取100 μL稀釋液涂布于CMC平板上，37℃培養24 h，挑選繁殖狀況好的菌落，加入1 mg/mL剛果紅染液，覆蓋菌落12 min后吸去剛果紅染液，再加入NaCl溶液漂洗，觀察透明圈大小，保留圈大的菌落，即完成初步篩選。

2)純化培養。在超凈工作臺用滅過菌的接種環挑取初步篩選得到的少許菌落，接種至LB培養基中搖床培養12 h，用三線法在CMC培養基上純化，37℃培養24 h，完成第1次純化培養，重復上述步驟培養4～5次。

3)復篩。在CMC培養基上點種，向培養基中倒入剛果紅染液，靜置12 min左右，NaCl溶液漂洗，并根據透明圈直徑和菌落直徑大小選擇優質菌株。

1.2.3 濾紙降解測定 向濾紙條培養基中加1 mL菌液，濾紙大小為5 cm×1 cm，搖床培養1～12 d，每天定時觀察濾紙的崩解情況[16]。

1.2.4 糖化水平測定 葡萄糖(還原糖)測定采用DNS顯色法[20]。調整菌株濃度的OD540為0.5，然后以1∶100的比例接種到產酶培養基上制備粗酶液。粗酶液和緩沖液中的碳源充分反應后，煮沸滅活，在室溫下測OD540值，計算菌株的產糖量。

1.2.5 酶活力測定 將pH 4.8，50℃條件下1 min內將底物轉化為1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U/mL)[21]。酶活力的計算公式：

X=[(A1-A2)×K+c]/(M×t)×1000

式中，X為CMCase活力，A1為OD540值，A2為對照OD540值，K為斜率，c為截距，M為葡萄糖的分子量，t為時間。

1.2.6 分離菌株鑒定

1)形態學鑒定。觀察細菌在CMC培養基上的生長狀況，包括形狀、形態、透明度、顏色及菌落質地等。

2)革蘭氏染色。參照寧俊平[22]的方法，通過革蘭氏染色對菌體進行形態學鑒定。

3)分子鑒定。通過CTAB法[23]和溶菌酶[21]相結合提取細菌基因組DNA。將提取的基因組DNA作為模板，PCR擴增菌株的16S rRNA基因[24]。所得擴增后產物由北京中科希林生物科技公司測序。將測序結果在NCBI瀏覽器上用BLAST 程序進行同源性分析，用Mega 7.0.26中的neighbor-joining法構建菌株的系統發育樹。

1.2.7 菌種的生長特性 調整菌液OD600=0.5作為種子液。以1∶100的比例接種至LB培養基中，每隔4 h測其OD600，并用PBS緩沖溶液做對照，記錄菌比體的生長情況并繪制菌絲體的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

從表1和圖1看出，反復劃線培養4～5次，經剛果紅染色，篩選出7株透明圈較明顯的菌株，將其分別編號為LY-1、LY-2、LY-3、LY-4、LY-5、LY-6和LY-7。點種復篩后，各菌株在CMC培養基上的菌落直徑(d)與降解圈直徑(D)比的大小依次為LY-5>LY-6>LY-3>LY-1>LY-7>LY-4>LY-2。其中，菌株LY-1、LY-3、LY-5和LY-6的透明圈直徑比較大，可用于后續試驗。

表1 纖維素降解菌株的菌落與降解圈直徑Table 1 Colony and degradation circle diameter of cellulose-degrading strain

圖1纖維素降解菌株 LY-1、LY-3、LY-5和 LY-6剛果紅染色
Fig.1 Congo red staining of cellulose-degrading strains LY-1,LY-3,LY-5 and LY-6

2.2 分離菌株對濾紙條的降解

將菌株LY-1、LY-3、LY-5和LY-6進行濾紙條降解試驗，結果表明，菌株LY-1和LY-5處理的溶液變渾濁，濾紙條接近糊狀，菌株LY-6處理的濾紙條成糊狀，菌株LY-3處理的濾紙條幾乎不降解。

2.3 分離菌株的糖化水平與酶活力

由圖2可見分離菌株的糖化水平與酶活力。1)糖化水平。4株菌株的糖化水平依次為LY-6>LY-1>LY-5>LY-3，其中，菌株LY-6產糖量最高，為0.045 mg/mL；其次是菌株LY-1，產糖量為0.035 mg/mL；菌株LY-3產糖量最低，為0.021 mg/mL。2)酶活力。4株菌株產纖維素酶的活力存在差異，其酶活力依次為LY-6>LY-1>LY-5>LY-3，其中，菌株LY-6的酶活力最高，為0.004 8 U/mL；菌株LY-3的酶活力最低，僅為0.001 3 U/mL。選擇菌株LY-6進行鑒定。

圖2 纖維素降解菌 4個菌株的糖化水平與酶活力Fig.2 Saccharification level and enzyme activity of the four cellulose-degrading strains

2.4 菌株 LY-6的鑒定

2.4.1 形態學鑒定 從圖3可見，菌株LY-6的菌落呈近圓形，較小，不透明，表面光滑，呈乳白色，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[25]初步鑒定LY-6為芽孢桿菌屬的細菌。

圖3 纖維素降解菌株 LY-6的菌落形態Fig.3 Colony morphology of cellulose-degrading strain LY-6

2.4.2 菌株LY-6的16S rRNA基因序列分析 對提取基因組DNA進行PCR擴增，發現目的條帶大小為1 500 bp左右(圖4)。將基因序列在NCBI分析結果顯示，菌株LY-6的16S rRNA基因序列長度為1 183 bp，其與多株芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列的相似性高達97%。從Mega 7.0.26構建的菌株LY-6系統進化樹(圖5)看，該菌株與BacillussafensisstrainNBRC 100820的親緣關系最近，相似性為99%，由此可確定菌株LY-6為沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)，命名為BacillussafensisLY-6。

圖4 纖維素降解菌株 LY-6的PCR 產物電泳圖Fig.4 Polymerase chain reaction product electrophoresis of cellulose-degrading strain LY-6

2.5 菌株 LY-6的生長曲線

由圖6可知，BacillussafensisLY-6在培養4～16 h內，菌株的生長速率快，呈指數增長。在培養16～20 h內，B.safensisLY-6處于穩定期，OD600值最高可達0.804。24 h后菌株數量開始下降。

圖5 纖維素降解菌株LY-6 16S rRNA 基因序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of LY-6 16S rRNA gene sequence of cellulose-degrading strain

圖6 纖維素降解菌株 LY-6的生長曲線Fig.6 Growth curve of cellulose-degrading strain LY-6

3 結論與討論

從落葉腐殖質土樣中分離篩選出的7株產纖維素酶菌株中，菌株LY-6的產酶特性最強，經鑒定，該菌株為沙福芽孢桿菌(BacillussafensisLY-6)。該菌株在培養16～20 h內生長比較穩定，OD600值最高可達0.804。剛果紅染色LY-6菌株在CMC培養基上的透明圈直徑為1.40 cm，較明顯，該菌株的產糖量和產纖維素酶的活力分別為0.045 mg/mL和0.004 8 U/mL。

目前，真菌和細菌是分解纖維素的主要微生物。真菌通過胞外游離纖維素酶起作用，而細菌通過形成多酶復合體結構起作用[26-28]。與真菌相比，細菌有生長速度較快、發酵時間短及產纖維素酶更容易獲得的優點。顧挺等[29]從種稻紅壤篩選出枯草芽孢桿菌和綠色木霉菌；李潔等[15]從種竹林地紅壤篩選出1株芽孢桿菌；不同菌株適宜不同類型的土壤[9-16]，該研究篩選出的沙福芽孢桿菌來自落葉豐富的腐殖質土壤。

當代社會生態問題極其重要，纖維素是巨大的可再生資源，利用微生物分解纖維素資源，實現生物量的轉化和利用，有利于社會的可持續發展。纖維素酶在工業、食品、醫藥方面均有很大的應用潛力[30-31]。該研究篩選的BacillussafensisLY-6屬沙福芽孢桿菌，其可以直接降解纖維蛋白，并且對血栓中的纖維蛋白有一定的降解特異性，對于口服溶栓藥的開發具有重要意義[30]。沙福芽孢桿菌纖溶酶活性較好，具有潛在開發價值。