β-catenin、COX-2、15-PGDH在結直腸癌組織中的表達及意義

蔣海濤 徐穎 王興蘭 杜勝奇 鐘江利 王紅

(遵義醫學院附屬醫院 1消化內科，貴州 遵義 563003；2腫瘤科；3呼吸與危重癥醫學科呼吸二病區)

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其早期診斷困難、死亡率高，最新報道指出，在全球范圍內結直腸癌的發病率占惡性腫瘤第4位(6.1%)，死亡率高居第3位(9.2%)〔1〕。結直腸癌的發生發展是多步驟多階段的復雜過程，目前研究已發現多種信號通路可能參與了結直腸癌的發生發展過程，如Wnt/β-連環蛋白(catenin)、Notch、JAK/STAT3等信號通路〔2,3〕。合成前列腺素的關鍵限速酶環氧合酶(COX)-2在多種腫瘤尤其是消化道腫瘤組織中表達上調；而前列腺素降解酶15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)在多種腫瘤組織中表達下調；在結直腸癌的研究中亦有類似的結論。Wnt/β-catenin、COX-2、15-PGDH在結直腸癌演變過程中均發揮了重要作用，但其具體機制及相互作用尚不明確。本實驗旨在探討β-catenin、COX-2、15-PGDH在結直腸癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集遵義醫學院附屬醫院手術切除的結直腸癌標本30例(腸癌組)，內鏡下手術切除的結直腸腺瘤標本30例(腺瘤組)，正常結直腸黏膜組織10例(正常組)。所有標本病理及臨床資料完整，所有手術患者術前均無放、化療，無非甾體抗炎藥治療。在30例結直腸癌標本中，右半結腸癌9例，乙狀結腸癌7例，直腸癌14例，其中男17例，女13例，年齡33～80歲，平均58.5歲，<60歲11例，≥60歲19例。

1.2主要試劑 逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒、引物合成、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒為寶生物工程公司提供，鼠抗-β肌動蛋白(actin)、脫脂奶粉為博士德生物有限公司提供，抗前列腺素脫氫酶、抗-β-catenin抗體為Abcam公司提供，兔抗-Cox-2/COX-2為北京博奧森生物技術有限公司提供，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)為碧云天生物技術研究所提供，焦碳酸二乙酯原液、多聚耐氨酸、通用二抗試劑盒為北京博奧森生物技術公司提供，超低蛋白分子量Marker為Sigma公司提供。

1.3實時熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測mRNA表達 使用Trizol試劑提取組織總RNA，按逆轉錄試劑盒(寶生物工程有限公司)說明合成cDNA。目的基因β-catenin引物，上游：5′-GCTGATCTTGGA CTTGATATTGGTG-3′，下游：5′-GTCCATACCCAAGGCATCCTG-3′；COX-2上游：5′-CCAGCACTTCACGCATTCCA-3′，下游：5′-GCTGTCTAGCCAGAGTTT CACC-3′；15-PGDH上游：5′-TGACTCATCCTGTCTGCTAACTCCA-3′，下游：5′-AGGGCAAGATATGACA ACATTCCA-3′。內參照β-actin上游：5′-CCAG GGCGTTATGGTAGGCA-3′,下游：5′-TTCCATATCCCAGTTGGT-3′。分別測定COX-2、15-PGDH與內參β-actin的PCR擴增產物的吸光度值，其比值作為待測樣本mRNA表達水平。

1.4Western印跡法檢測相關蛋白表達 將提取的結直腸組織蛋白與預染蛋白Marker一起上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后電轉移至聚偏氟乙烯(PDVF)膜，置于配置好的5%脫脂奶粉/封閉1 h，加入一抗〔目的蛋白：兔抗人多克隆抗體β-catenin(1∶4 000)、COX-2(1∶500)、15-PGDH(2 μg/ml)，內參β-actin小鼠抗人單克隆抗體(1∶400)〕；4℃過夜后加入二抗(山羊抗兔、山羊抗小鼠抗體，均以1∶1 000配制)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，化學發光試劑(ECL)顯色劑完成顯色及曝光。

1.5免疫組化法檢測相關蛋白表達 所有組織標本石蠟固定后連續切片，經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸鹽抗原修復等步驟后，使用免疫組織化學SP法進行染色，二氨基聯苯胺(DBA)顯色劑顯色，所用抗體濃度分別為兔抗人多克隆抗體β-catenin(1∶400)、COX-2(1∶500)、15-PGDH(1∶500)。采用半定量積分法進行結果判定。β-catenin在正常結直腸組織中定位于細胞膜，陽性表達為細胞質、細胞核中出現棕黃色至棕褐色顆粒。COX-2、15-PGDH定位于細胞質或細胞核，陽性表達為胞質、胞核中出現淺黃色至棕黃色顆粒。首先在低倍鏡下瀏覽整張切片，選擇高表達區域在高倍鏡下進一步觀察，共觀察5個高倍視野，每個視野記數200個細胞，共計數1 000個，根據染色深度和陽性細胞率分別評估，綜合判定。①按染色深度評分：無染色0分，淺黃色顆粒1分，棕黃色2分，深棕色3分。②按陽性細胞的比率評分：陽性細胞數占總細胞數<10%計0分，≥10%且<25%計1分，≥25%且<50%計2分，≥50%計3分；③每張玻片總積分為2項評分相加：0～1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性()，5～6分為強陽性()，≥2分為陽性表達。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1RT-PCR及Western印跡法檢測結果 β-catenin及COX-2 mRNA及蛋白在正常組、腺瘤組、腸癌組表達呈逐漸升高趨勢(P<0.05)。15-PGDH mRNA及蛋白在正常組、腺瘤組、腸癌組表達呈逐漸降低趨勢(P<0.05)。見圖1、表1。

A、B:正常組;C～E：腺瘤組;F、G:腸癌組圖1 各組β-catenin、COX-2、15-PGDH 蛋白表達

表1 各組β-catenin、COX-2、15-PGDH mRNA及蛋白表達

與正常組比較：1)P<0.05；與腺瘤組比較:2)P<0.05；下表同

2.2免疫組化結果 β-catenin和COX-2在正常組、腺瘤組、腸癌組的陽性標的率和表達強度均呈逐漸上升趨勢(P<0.05)。15-PGDH在腺瘤組和腸癌組中表達明顯低于正常組(P<0.05)，且腺瘤組顯著低于腸癌組(P<0.05)。見圖2～4、表2。

圖2 β-catenin在3組中的表達(SP,×400)

圖3 COX-2在3組中的表達(SP,×400)

圖4 15-PGDH在3組中的表達(SP,×400)

表2 各組β-catenin、COX-、15-PGDH蛋白表達(n,n=20)

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路調節細胞增殖和分化，精細地調控著細胞的生命活動，是胚胎生長發育必需的重要通路，而該通路的過度激活或異常表達可導致腫瘤發生〔4,5〕。在諸多信號通路中，Wnt/β-catenin信號通路是研究較早、較深入的信號通路之一；在結直腸癌中，有研究發現超過94%的結直腸癌患者存在Wnt信號通路的異常表達和激活〔6〕。Wnt/β-catenin信號通路是經典的Wnt通路，β-catenin是該信號通路的關鍵蛋白。在正常結直腸組織中，β-catenin表達在細胞膜，在胞質和胞核中少見，當Wnt/β-catenin通路被異常激活后，β-catenin在胞質和胞核出現大量聚集，激活下游的靶基因，使腫瘤干細胞的自我更新和分化功能異常，從而導致腫瘤的發生。本實驗表明，在正常結直腸組織、結直腸腺瘤、結直腸癌組織中β-catenin的表達呈逐漸增強趨勢。免疫組化結果顯示β-catenin在正常結直腸組織中主要表達在細胞膜，在胞質和胞核中鮮有表達，而隨著正常組織、腺瘤、結直腸癌的演變，β-catenin在胞質和胞核中出現聚集且逐漸增強，在結直腸癌中表達陽性率最高，陽性強度最強。由此推測，在結直腸組織中β-catenin的高表達極有可能促進了結直腸腫瘤的發生，而β-catenin異位高表達可能是β-catenin在胞質中的降解異常所致。

Wnt/β-catenin在結直腸癌中的研究并非孤立，多種基因與之存在相互作用，研究發現近80%的結直腸癌中出現COX-2陽性表達〔7〕，COX-2被激活后產生的前列腺素(PG)E2使降解復合體解聚，導致β-catenin不能被正常磷酸化和降解，從而激活下游靶基因并促進結直腸腫瘤的發生。亦有研究認為，Wnt信號通路激活后，β-catenin與T細胞因子(TCF)-4結合，而TCF-4正好位于COX-2的轉錄啟動子內，即COX-2是Wnt/β-catenin通路的靶基因之一。COX-2在癌癥中研究已久，早在20余年前DuBois等〔8〕的報道就指出85%～90%的結直腸癌和40%～50%有惡變傾向的結直腸腺瘤中出現COX-2的高表達。有國外學者使用人工合成的COX-2選擇性抑制劑進行腫瘤的預防、治療并取得了顯著的成果，其主要原因是抑制了PG的合成〔9〕。本研究推測在結直腸組織中COX-2的表達上調極有可能促進了結直腸癌的發生、發展，而β-catenin與COX-2在結直腸癌的發生、發展等過程中是否存在相互關系及其機制目前尚不明確。

COX-2是合成PG的關鍵限速酶，而15-PGDH是降解前列腺素的關鍵酶，對COX-2有生理性的拮抗作用。15-PGDH廣泛存在于哺乳動物體內，在正常的胃、結直腸、肺、腎、乳腺等組織中均有高水平表達，可催化活性較強的15-羥基PG轉化為活性較低的15-酮基PG，從而降解PG〔10〕。近年來，COX-2與15-PGDH在腫瘤中的關系備受關注。Lim等〔11〕研究發現，在結直腸癌中15-PGDH 的陽性率為46.1%，而COX-2的陽性率高達80.5%。Yang等〔12〕進一步研究認為，15-PGDH的早期失活，伴隨著COX-2的激活，促進了PGE2的產生，并導致了結直腸癌的發生。本實驗結果與國內外研究結果一致，由此推測，在結直腸組織中15-PGDH可能充當COX-2的拮抗劑，抑制COX-2活性的增加從而抑制結直腸癌的發生、發展，發揮抑癌基因的作用。

綜上，β-catenin、COX-2在結直腸組織中的異位及異常高表達可能在結直腸癌的發生、發展過程中發揮了關鍵作用，而15-PGDH在結直腸組織中的表達降低或缺失可能也促進了結直腸癌的發生、發展。