NF-κB信號通路關鍵蛋白I-κBα的磷酸化與結直腸癌組織發生發展的關聯性

陳昱江 楊茂 李騰仙

(貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

I-κB是核因子(NF)-κB的抑制蛋白，靜息狀態下，I-κB抑制NF-κB活化，當刺激因子刺激細胞時，I-κB蛋白磷酸化激活NF-κB〔1,2〕。NF-κB是一種可以介導免疫細胞增殖、分化和炎性因子產生的物質，NF-κB通路異常會導致慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤的生長和轉移〔3,4〕。結直腸癌的發生發展與NF-κB通路異常有密切聯系。本研究針對I-κB蛋白磷酸化在炎癥因子高表達的結直腸癌組織中的作用進行探討。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年1月貴陽中醫學院第一附屬醫院進行結直腸癌治療的患者30例作為病例組，另選取2017年1月至2018年1月行腸鏡活檢且結直腸正常的患者30例作為對照組。病例組男21例，女9例，年齡40～70歲，平均年齡(59.33±8.45)歲，體重55～75 kg，平均體重(62.46±7.42)kg；對照組男20例，女10例，年齡40～70歲，平均年齡(58.25±8.74)歲，體重55～75 kg，平均體重(63.48±7.47)kg，病例組取癌組織、癌旁2 cm和距離癌組織10 cm以上的健康組織各1例。納入標準：病例組經乙狀結腸鏡、纖維結腸鏡檢查、活體組織檢查確診為結直腸癌，對照組經乙狀結腸鏡、纖維結腸鏡檢查、活體組織檢查確診為結直腸正常。排除標準：有其他腫瘤疾病；患有嚴重心臟、肝臟、腎臟功能不全；依從性差。患者均簽署知情同意書，研究過程符合人體倫理學原則，研究過程通過本院的倫理審查。兩組患者基線資料比較，差異不具有統計學意義(P>0.05)。

1.2標本儲存 血液標本采集后加入乙二胺四乙酸(EDTA)進行抗凝處理，并離心取上清，放入-80℃(Thermo)儲存備用；所有組織標本在取出后立即置入液氮中(-198℃)進行保存。

1.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 采用ELISA試劑盒(Sigma，美國)檢測兩組血清炎癥因子白細胞介素(IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達量。

1.4RT-QPCR 組織RNA的抽提采用OMEGA總RNA試劑盒(R6834-02)，并嚴格按著說明書進行操作。引物序列：IL-1 上游5′ CCACAGACCTTCCAGGAGAATG 3′,下游5′ GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG 3′;IL-6 上游5′AGACAGCCACTCACCTCTTCAG 3′，下游5′ TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG 3′；TNF-α上游5′ CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG 3′，下游5′ ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC 3′。Q-PCR操作過程和反應體系按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，Bulk(RR420L)的說明書進行操作，結果采用2-△△Ct表示。

1.5Western印跡法 抽提組織蛋白后加入TaKaRa 1×結合緩沖液100℃ 3～5 min變性，存入-20℃進行保存，采用碧云天Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白定量后每個孔10 μl樣品進行上樣，以恒電壓120 V進行電泳65 min，后以恒電流400 mA進行濕轉70 min。 NF-κB和I-κB一抗和二抗均購于賽信通公司(CST)，一抗稀釋濃度1∶2 000，二抗稀釋濃度1∶1 000，發光液為購買于碧云天的超敏電化學發光(ECL)試劑盒，1∶1等體積混合A、B液，進行化學發光，采用Image J軟件進行灰度分析。

1.6統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1兩組血清IL-1、IL-6、TNF-α表達水平比較 病例組血清炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清IL-1、IL-6、TNF-α表達水平比較

2.2不同組織中炎癥因子的表達 癌組織中IL-1、IL-6和TNF-α mRNA表達量顯著高于癌旁組織和正常組織，且癌旁組織上述指標顯著高于正常組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同組織中炎癥因子的表達情況

與癌旁組織比較：1)P<0.001;與正常組織比較：2)P<0.001

2.3不同組織中TLR通路轉錄因子NF-κB和I-κB的表達 NF-κB和β-actin在癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達灰度值相比，差異不具有統計學意義(P>0.05)，但正常組織的I-κB蛋白表達量顯著高于癌旁組織和癌組織，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表3。

2.4I-κB與不同組織中炎癥因子表達的關聯性 病例組中I-κB的表達與組織中炎癥因子IL-1(r=-0.551，P=0.031)、IL-6(r=-0.658，P=0.004)和TNF-α(r=-0.947，P=0.000)表達呈顯著負相關。

表3 不同組織中NF-κB和I-κB的表達灰度分析

與正常組織比較：1)P<0.001

3 討 論

結腸直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，好發于中年以上的男性，以40～70歲最為多見，主要臨床表現為排便習慣改變、便血、局部腹痛等癥狀〔5〕。研究證實，I-κB基因表達缺失和NF-κB持續激活是該病發生的主要原因〔6〕。I-κB是NF-κB信號通路中重要的成員，參與NF-κB的激活與轉錄〔7〕。在靜息狀態下，I-κB和NF-κB雜二聚體以結合的形式存在于細胞質中，抑制NF-κB的活化，當各種刺激因子(如氧自由基、病毒蛋白、細胞因子等)級聯信號迅速激活I-κB激酶(IKK)復合物，被激活的IKK磷酸化I-κB N端的32、36位絲氨酸，磷酸化(p)-I-κBα21、22位賴氨酸發生泛素化降解并脫離NF-κB，使NF-κB核定位信號區(NLS)暴露，促進NF-κB磷酸化、核轉移和進入細胞核，介導特異性基因的轉錄表達〔8，9〕。此時NF-κB持續激活，介導結直腸癌細胞因子釋放。本研究結果說明I-κB基因表達缺失使原本處于靜息狀態的NF-κB被持續激活，促進了機體免疫應答和炎性因子的產生。研究表明，炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平上升能進一步促進NF-κB活化〔10〕，炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平和NF-κB被激活起相互促進作用。隨著NF-κB表達的升高，越來越多I-κB表達缺失，所以病例組中I-κB的表達與組織中炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α水平在Pearson線性相關結果顯示中呈負相關。

本研究結果說明炎性因子的表達水平和所處組織環境有關。研究表明，炎性反應和腫瘤之間存在密切聯系，高達20%的腫瘤來源于慢性炎癥反應和持續性感染〔11〕。在慢性炎性反應過程中，炎性細胞產生的炎性因子和細胞因子將激活NF-κB信號通路，增強癌前細胞的逃逸能力〔12〕。研究證實，腫瘤的生長依賴于腫瘤血管的生成，而NF-κB在腫瘤血管形成過程中可能也起到關鍵作用〔13，14〕。一項研究指出，許多血管生成因子，如轉化生長因子(TGF)-β、TNF-α、IL-8等均含有NF-κB的特異性結合位點，表達受到NF-κB的調控〔15〕。mRNA攜帶著遺傳信息，在蛋白質合成時充當模板，mRNA在癌組織中表達量最高，說明癌組織炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α水平最高，也進一步說明癌組織中NF-κB被激活的數量最大，I-κB表達缺失最多，而正常組織中IL-1、IL-6和TNF-α的mRNA表達量最低，推測I-κB蛋白磷酸化在炎性因子高表達的結直腸癌中起到重要作用，I-κB表達下調是導致結直腸癌發病和炎性反應的主要原因。

目前關于細胞免疫和炎性疾病的發病機制尚不明確，臨床用藥多以非特異性抗炎藥物和細胞毒性藥物為主，如糖皮質激素、丙種球蛋白等。長期使用這些藥物副作用較大，針對性治療效果較差，給患者生存質量帶來不利影響。本研究結果推測，I-κB表達缺失可能介導了結直腸癌中炎性因子的高表達，靶向調節I-κB具有潛在治療前景。但靶向調節I-κB能否成為治療結直腸癌患者炎性反應、抑制腫瘤生長轉移的新方法，還有待進一步開展大量臨床研究。