1，25-(OH)2D3 對(duì)阿霉素腎病模型大鼠足細(xì)胞損傷及podocin表達(dá)缺失的影響

趙丹 陳亞茹 于曼麗 馬國(guó)英 楊曉萍 羅星

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆 石河子 832002;2生化教研室)

近年來(lái)，慢性腎臟病(CKD)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。腎臟作為人體重要的新陳代謝器官，其病理結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致腎臟功能逐漸喪失的因素，目前的治療方法不足以避免這種疾病的發(fā)展〔1〕。研究表明，維生素D3缺乏可提高罹患腎病的風(fēng)險(xiǎn)，避免維生素D3缺乏和補(bǔ)充維生素 D3可能是一種既經(jīng)濟(jì)又安全的降低CKD 發(fā)病率，并提高其預(yù)后的方式〔2〕。維生素D是強(qiáng)效類(lèi)固醇激素骨化三醇的前體，活化的維生素D3在促進(jìn)鈣磷吸收、防止血管鈣化、維持宿主對(duì)病原體的防御等方面發(fā)揮重要作用〔3〕。維生素D受體(VDR)是核受體超家族成員，細(xì)胞膜上的VDR磷酸化后與視黃體受體(RXR)結(jié)合形成異二聚體，在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)維生素D的活性并與維生素D元素(VDREs)結(jié)合，在目標(biāo)基因區(qū)域里調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔4〕。腎臟足細(xì)胞是活性維生素D3〔1,25-(OH)2D〕發(fā)揮作用的重要靶器官，在維持腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)podocin為足細(xì)胞重要的標(biāo)記物，是腎小球足細(xì)胞信號(hào)傳遞的重要分子蛋白〔6〕。足細(xì)胞裂孔膜蛋白(Nephrin)是足細(xì)胞主要的裂孔隔膜標(biāo)記分子，其基因突變是導(dǎo)致腎小球裂孔隔膜蛋白表達(dá)異常從而產(chǎn)生蛋白尿的重要原因〔7〕。而關(guān)于podocin的研究相對(duì)較少，它在CKD中的作用及機(jī)制仍不明確。本次研究擬探討1，25-(OH)2D3對(duì)阿霉素(ADR)腎病模型大鼠的治療效果及對(duì)足細(xì)胞podocin定位、表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只體重180～220 g的SPF級(jí)雄性成熟 Sprague Dawley(SD)大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物安置在石河子大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，并維持1 w適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.1.2主要藥物和試劑 注射用鹽酸ADR(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司)；骨化三醇(上海羅氏制藥有限公司)；兔單抗 podocin (美國(guó) abcam 公司)；山羊抗兔二抗、PV-9000 通用型二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋有限責(zé)任公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒 AR1022 (丹麥 DAKO 公司)。

1.2方法

1.2.1ADR腎病模型的建立 隨機(jī)選擇60只SD大鼠，單次尾靜脈注射ADR(劑量為7.5 mg /kg)建立ADR腎病模型，注射2 w后測(cè) 24 h 尿蛋白定量，24 h 尿蛋白定量>30 mg提示ADR腎病模型建造成功。對(duì)照組予單次尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.2.2給藥 ADR腎病模型建立成功后被隨機(jī)分為ADR組、1，25-(OH)2D3治療(治療)組，每組30只。治療組每日給予0.25 μg/kg 的 1，25-(OH)2D3灌胃，對(duì)照組與ADR組給予等量的花生油灌胃。于治療第2、4、6、8、10周，各組分批次處死 6 只大鼠，處死前，代謝籠收集 24 h 尿量，腎臟組織剝離，-80°C 保存或4%多聚甲醛固定。

1.3相關(guān)檢查

1.3.1一般狀況 ①觀察各組大鼠休息、活動(dòng)、飲食、排泄等生活習(xí)性的變化；② 24 h 尿蛋白定量：各大鼠獨(dú)立喂養(yǎng)于代謝籠中，收集 24 h 尿液，檢測(cè)尿蛋白含量。

1.3.2大鼠腎臟病理觀察 10%水合氯醛麻醉大鼠，行腎被膜快速剝離術(shù)，固定在10%的甲醛中，并嵌入石蠟，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察，供腎組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.3.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)和半定量分析 固定的腎組織石蠟包埋，0.4 μm石蠟切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液(pH6.0) 200 ml 高壓抗原修復(fù)，冷卻，3% 過(guò)氧化氫(H2O2)封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 5 min、3 次，滴加抗podocin單克隆抗體(1∶500)；4℃孵育過(guò)夜；次日早晨復(fù)溫、浸洗，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，PBS 洗 5 min、3次，滴加適量的增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物，DAB 顯色、復(fù)染、中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察 podocin 定位。每張切片中，隨機(jī)選取5個(gè)腎小球視野，Image-pro Plus6.0處理，計(jì)算陽(yáng)性積分吸光度，半定量分析蛋白表達(dá)。

1.3.4腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 1 mm3的腎皮質(zhì)組織先后固定在2.5%戊二醛和1%的鋨酸中，然后過(guò)分級(jí)乙醇，環(huán)氧丙烷脫水，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序嵌入 Epon812，超薄切片被醋酸鈾著色10 min，然后雷諾鉛檸檬酸鹽染色處理2 min，封片、鏡檢，觀察腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎組織podocin mRNA水平 Trizol法提取腎皮質(zhì)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)腎組織 podocin mRNA水平。podocin上游引物 5′-GTGGCTTCTTGTCCTCTCCT-3′，下游引物 5′-TGTGATAGGTGTCCAGGCAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為 185 bp；GAPDH 上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段253 bp。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s；60℃ 30 s；共 40 個(gè)循環(huán)。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以 2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.3.6Western印跡檢測(cè)podocin蛋白的表達(dá) 取100 mg腎皮質(zhì)組織，放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)提取總蛋白，二辛可酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度，平衡濃度后每泳道 50 μg 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠：83 V，30 min；分離膠：110 V，100 min；轉(zhuǎn)膜：23 V，60 min；轉(zhuǎn)膜完成后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。podocin 兔單克隆抗體(1∶2 000)4℃搖床孵育過(guò)夜，次日晨TBST洗一抗，山羊抗兔(1∶5 000)室溫 50 r/min孵育2 h，洗二抗后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑暗室曝光，Image Lab 系統(tǒng)處理圖像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件。計(jì)量資料多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般狀況和24 h 尿蛋白定量 對(duì)照組大鼠狀態(tài)佳，活潑好動(dòng)，機(jī)靈靈敏，有較高的應(yīng)激反應(yīng)，毛色致密有光澤；ADR組大鼠出現(xiàn)精神、神經(jīng)系統(tǒng)的改變：疲乏、怠倦少動(dòng)、對(duì)外界刺激反應(yīng)性較低，喜蜷臥，多飲、多尿，毛色無(wú)光澤，較散亂。與對(duì)照組比較，ADR組24 h尿蛋白定量明顯增高，1，25-(OH)2D3治療能降低蛋白尿(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn) 24 h 尿蛋白定量比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與ADR組比較：2)P<0.05；下表同

2.21，25-(OH)2D3對(duì)腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 對(duì)照組足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，胞核形態(tài)良好，足突沿胞體指杵狀向外延伸，相互交錯(cuò)；ADR組足細(xì)胞內(nèi)有脂滴且呈現(xiàn)細(xì)胞空腔、細(xì)胞核畸形，基底膜呈節(jié)段性增厚、足突被壓扁且融合；1，25-(OH)2D3治療后，治療組畸形細(xì)胞核有所修復(fù)，基底膜無(wú)增厚，足突融合減輕，足細(xì)胞數(shù)量增加。見(jiàn)圖1。

圖1 1，25-(OH)2D3對(duì)ADR腎病模型大鼠足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響(醋酸鈾染色，×10 000)

2.3腎組織病理學(xué)改變 腎臟 HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組腎小球形態(tài)完好，無(wú)腎小管結(jié)構(gòu)病理改變。ADR組出現(xiàn)腎組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常，第2周末，腎小球出現(xiàn)炎性細(xì)胞聚集，基底膜增厚，腎間質(zhì)纖維化；第10周可見(jiàn)腎小球病理改變加重，纖維樣壞死累及整個(gè)腎小球。1，25-(OH)2D3治療后，治療組腎小球病理?yè)p傷減輕，且第10周末腎小球形態(tài)較對(duì)照組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)podocin的定位和表達(dá) podocin 主要定位于細(xì)胞膜，且在毛細(xì)血管袢呈連續(xù)、線性排布；與對(duì)照組相比，各周末ADR組 podocin 陽(yáng)性表達(dá)面積明顯降低(P<0.05)；1，25-(OH)2D3治療后，治療組podocin 的表達(dá)時(shí)間依賴(lài)性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖 3。

2.51，25-(OH)2D3對(duì)ADR腎病模型大鼠腎組織podocin mRNA 表達(dá)的影響 對(duì)照組 podocin mRNA 表達(dá)量較高，與對(duì)照組相比，ADR組 podocin mRNA 的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與ADR組相比，隨著1，25-(OH)2D3療程增加，大鼠腎組織 podocin mRNA 的表達(dá)有所升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.61，25-(OH)2D3對(duì)ADR腎病模型大鼠足細(xì)胞 podocin 蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組 podocin 蛋白表達(dá)較高，與對(duì)照組相比，ADR組podocin表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與ADR組比較，經(jīng)1，25-(OH)2D3治療后，治療組腎小球足細(xì)胞 podocin 的表達(dá)顯著上調(diào)，在第10周末，基本恢復(fù)至正常水平。見(jiàn)圖4，表4。

圖2 治療后不同時(shí)間點(diǎn)1，25-(OH)2D3 對(duì)ADR腎病模型大鼠腎組織病理學(xué)影響(HE，×400)

表2 各組治療后不同時(shí)間點(diǎn)腎組織 podocin 蛋白半定量表達(dá)的比較

圖3 治療后不同時(shí)間點(diǎn)1，25-(OH)2D3對(duì)ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin 蛋白表達(dá)的影響(IHC，×400)

表3 治療后不同時(shí)間點(diǎn)1，25-(OH)2D3 對(duì)ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin mRNA表達(dá)的影響

圖4 治療后不同時(shí)間點(diǎn)1，25-(OH)2D3 對(duì)ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin 蛋白表達(dá)的影響

表4 治療后不同時(shí)間點(diǎn)1，25-(OH)2D3 對(duì)ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

CKD最終可進(jìn)展為終末期腎病，需要長(zhǎng)期腎替代治療或腎移植，已經(jīng)成為危及人類(lèi)生命和健康的重要疾病之一。CKD的特征是出現(xiàn)腎單位減少、大量蛋白尿、腎功能損害等，這很大程度上歸因于慢性腎小球腎炎、高血壓、代謝綜合征、糖尿病等危險(xiǎn)因素〔8〕。ADR模型是目前模擬人類(lèi)CKD的較為成熟的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，這種模型的建立簡(jiǎn)便、成功率高，蛋白穩(wěn)定(有報(bào)道可達(dá) 9 個(gè)月〔9〕)，且藥源充足。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一次性尾靜脈注射ADR 7.5 mg/kg，也成功建立了ADR模型。

有活性的維生素 D3 缺乏是CKD蛋白尿的關(guān)鍵原因，早期補(bǔ)充1，25-(OH)2D3具有重要的腎臟保護(hù)作用〔10〕。大量蛋白尿與腎臟損傷密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3能有效改善腎病理?yè)p傷，發(fā)揮腎小球保護(hù)作用，減少蛋白尿〔11〕。本研究結(jié)果提示，腎組織結(jié)構(gòu)的損傷是加速CKD進(jìn)程的關(guān)鍵，給予1，25-(OH)2D3能有效減緩慢性病程的發(fā)展。

圍繞著毛細(xì)血管和鮑曼囊高度轉(zhuǎn)化的腎小球足細(xì)胞，足部間相互交錯(cuò)，形成一個(gè)狹窄均勻的動(dòng)態(tài)縫隙網(wǎng)絡(luò)，維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，是腎小球?yàn)V過(guò)過(guò)程的最后環(huán)節(jié)〔12〕。近年來(lái)，關(guān)于腎臟的研究主要集中在 nephrin、CD相關(guān)蛋白2(CD2AP)、足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(WT)-1 等幾個(gè)重要的分子〔13〕。podocin 是最新發(fā)現(xiàn)的足細(xì)胞特異性標(biāo)記分子，在足突膜脂筏中發(fā)揮著腳手架的作用〔14〕。除了結(jié)構(gòu)作用外，其在腎小球足細(xì)胞啟動(dòng)磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B (PI3K/AKT)信號(hào)通路〔15〕。已有研究報(bào)道nephrin-CD2AP-podocin 復(fù)合體的形成，參與 PI3K/AKT 信號(hào)分子的傳遞，抑制足細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖，保護(hù)足細(xì)胞，改善蛋白尿〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎臟足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致大量蛋白尿的關(guān)鍵，為后續(xù)臨床治療提供重要的靶標(biāo)基礎(chǔ)。

綜上，腎臟損傷，尤其腎臟足細(xì)胞的損害，包括結(jié)構(gòu)上足突融合及分子水平podocin 的缺失是導(dǎo)致蛋白尿的關(guān)鍵原因，而1，25-(OH)2D3在一定程度上能夠修復(fù)腎足細(xì)胞的損傷，改善 podocin 蛋白表達(dá)的缺失，進(jìn)而減少蛋白尿，發(fā)揮其重要的腎保護(hù)作用。而1，25-(OH)2D3通過(guò)哪條途徑調(diào)節(jié) podocin 表達(dá)、保護(hù)足細(xì)胞，有待進(jìn)一步研究。