長爪沙鼠非酒精性脂肪肝肝硬化模型的建立

李巍 陳曉娟 張旭亮 石巧娟 陳振文

(1浙江大學實驗動物中心，浙江 杭州 310058；2浙江省醫學科學院；3首都醫科大學基礎醫學院)

目前全世界約20%的成年人患有非酒精性脂肪肝(NAFLD)〔1〕，肥胖人群的發病率則高達90%〔2〕。隨著中國經濟的快速發展，NAFLD患病率正逐年升高。NAFLD疾病譜由輕到重表現為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化和肝癌，據統計15%～50%肝硬化與脂肪肝有關〔3～6〕。預測NAFLD引發的肝硬化在未來十年將成為發達國家肝移植的首要原因〔7，8〕。NAFLD從單純脂肪變性到肝硬化的臨床進展通常需要幾十年。目前NAFLD診斷仍以病理學診斷為主要依據，肝活檢仍是診斷NAFLD疾病譜的金標準〔9〕。活檢難以反復取材且存在抽樣誤差〔10〕，任何一種非侵入診斷方法還不能完全代替肝穿刺活組織檢查〔11〕。此外，獲得人類肝臟組織還受道德約束的限制。長爪沙鼠是一種對膳食脂質比較敏感的動物〔12～14〕，本研究利用高脂飲食、雄性和脂質代謝紊亂等NAFLD臨床主要致病因素，以長爪沙鼠為實驗動物建立一種穩定的NAFLD肝硬化模型，并結合模型的病理過程、肝膠原沉積及相關細胞因子展開研究和評價。

1 材料與方法

1.1主要試劑 蛋黃粉購于浙江省長興艾格生物制品有限公司。膽固醇、三號膽鹽購于華東醫藥股份有限公司。食用豬油購于超市。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、基質金屬蛋白酶(MMP)13、組織MMP抑制劑(TIMP)1(美國Proteintech公司)。

1.2實驗動物 雄性Z：ZCLA長爪沙鼠40只，體重40～60 g，由浙江省實驗動物中心提供〔生產許可證號：SCXK(浙)2014-0001，使用許可證號：SYXK(浙)2014-0008〕。

1.3飼料配方 普通飼料及高脂飼料(HFD)由浙江省醫學科學院實驗動物中心加工生產，HFD配方見相關專利〔15〕。

1.4模型建立 適應性飼養1 w后，給予HFD進行喂養，動物自由進食飲水。于0、6、12和24 w末動物稱重，以1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血處死全部動物。

1.5標本采集及指標測定 取肝臟后，將肝最大葉中部用4%甲醛固定后制備石蠟切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色觀察病理變化；最大的肝葉中央部分(約1 mm3)2.5%的戊二醛4℃固定4 h后送中國科學院病毒研究所進行電鏡觀察；Western印跡法測定肝組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP1、MMP13蛋白表達。

1.6統計學處理 用SPSS11.5軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1肝臟外觀特征 0 w組肝臟肉眼觀察質地柔潤，邊緣尖銳，表面光滑，呈暗紅色(圖1A)。24 w模型組肝臟腫脹，體積增大，包膜緊張，邊緣鈍化，呈奶黃色，肝臟表面出現凹凸不平的結節(圖1B)。部分動物肝臟與周圍組織有粘連，切面油膩。

2.2各組沙鼠組織學改變 隨著飼喂時間延長動物不同階段臨床指證打分結果見表1。HE染色和Masson染色顯示，0 w組肝小葉結構完整，以中央靜脈為中心，肝細胞呈放射索狀排列，細胞大小均一，細胞核位于細胞正中，匯管區未見異常(圖2A、2D)。6 w后動物肝細胞30%～60%大泡性脂肪變性(圖2B)為單純性脂肪肝模型；12 w時動物肝臟細胞胞質透明，被大小不一的空泡所替代，間質有散在性多核白細胞及單個核細胞浸潤(圖2C)形成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型，肝細胞出現氣球樣變，尤其是肝小葉中心的肝腺泡Ⅲ區，部分細胞可觀察到Mallory小體(圖2E)。24 w時Masson染色可見動物肝臟中央靜脈及匯管區周圍纖維組織增生，呈條索狀向肝小葉內延伸，部分包繞肝小葉，出現假小葉結構，形成肝硬化模型(圖2F)。

圖1 飼喂不同時間肝臟外觀變化

表1 模型動物不同階段臨床指證打分表

1)顯微鏡下200倍視野

圖2 沙鼠HFD飼喂不同時間的肝臟病理變化(HE)

2.3電鏡下各組動物肝細胞超微結構及星狀細胞形態學觀察 0 w組動物肝細胞內散在少量的異染色質團塊，核質有均質細顆粒，胞質中線粒體呈現橢圓形或桿狀、電子密度較低，細胞核及胞質無異常變化(圖3A)。NASH動物模型肝細胞內出現脂滴，部分細胞出現細胞核變形、邊緣化，或核收縮變小、濃縮、甚至僅留下一個致密的團塊，出現凋亡；線粒體高度腫脹，密度增高并呈現多種形態(圖3B)。肝硬化階段動物肝細胞細胞核不規則，核邊聚，染色質濃縮凝結成塊，胞質內出現大量溝裂和空泡等，部分細胞可見凋亡小體；出現細胞膜、核膜破損，細胞壞死性死亡；線粒體高度腫脹，密度更高并呈現多種形態。內質網擴張，星狀細胞激活，胞質中脂滴消失，周圍有纖維束形成(圖3C；3D)肝細胞外及狄氏竇膠原纖維增生。

2.4Western印跡法檢測各組CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP1及MMP13蛋白表達情況 CollagenⅠ、CollagenⅢ在各組肝臟中的表達呈逐漸增強的趨勢，肝硬化時有顯著性升高(P<0.01，P<0.001)。特異性分解肝臟膠原蛋白的MMP13在肝硬化時明顯降低(P<0.01)，TIMP1則明顯升高(P<0.001)。見表2，圖4。

表2 飼喂不同時間CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TIMP1及MMP13蛋白表達變化

與0 w組比較:1)P<0.05,2)P<0.01，3)P<0.001

圖4 飼喂后各時間點CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP1及MMP13蛋白表達變化

3 討 論

NAFLD具有代謝綜合征的所有特征，目前大多數學者已經將NAFLD作為代謝綜合征的組分之一，或代謝綜合征在肝臟的表現〔16〕。而長爪沙鼠已被用于建立高膽固醇血癥、Ⅱ型糖尿病模型等代謝綜合征模型，課題組前期選擇長爪沙鼠成功的構建了NASH模型，并驗證了模型有較好的穩定性〔17，18〕。病因學調查發現，過去30年NAFLD患病率的增加主要是由于食物數量和成分改變所致，表現為飲食中高熱量、高脂肪等特點的西方膳食結構模式〔4〕。現有的NAFLD模型中，HFD飲食誘導模型的病因、發病背景方面與此類似。已有的HFD飲食誘導模型具有血脂紊亂、胰島素抵抗等代謝綜合征表現，鏡下可見脂肪變性、肝小葉炎癥、氣球樣變性。但它形成的肝臟纖維化、炎癥改變較輕，不能形成肝硬化。模型與人類疾病的發生發展仍然存在較大差異，這些差異部分是病因的差異，更急需解決的是疾病譜的差異，尤其是全譜模型的缺乏〔19，20〕。本研究模仿人類疾病高風險因素長期高脂飲食、男性、血脂紊亂等條件〔21〕，利用長爪沙鼠得到了NAFLD可以發展到肝硬化的全譜模型。本研究首次對NAFLD全譜模型進行全程監測，重點研究模型發展與形成肝硬化階段。沙鼠NAFLD與臨床患者有一定的相似性，與現有HFD飲食模型相比，沙鼠模型表現出更嚴重的組織病變，更深入的階段發展，模型后期病理及膠原蛋白的檢測結果，及文獻對模型后期羥脯氨酸含量的檢測結果〔17〕，均可證實模型經過單純性脂肪肝和NASH階段后，形成了肝硬化。在形成的過程中，首先發生了肝星狀細胞活化，之后產生了以膠原蛋白為代表的細胞外基質的沉積。在經歷了“膠原帶-橋接纖維化-肝硬化”典型發展模式后，最終形成了肝硬化。

肝硬化的實質是Collagen Ⅰ、CollagenⅢ等細胞外基質在肝內大量異常沉積。模型在纖維化前發生了星狀細胞活化，在各種原因導致的肝纖維化形成過程中都具有核心地位。星狀細胞激活后表達CollagenⅢ，隨后在數量上和活性上增加產生了CollagenⅠ。另外，特異性降解細胞外基質的間質膠原酶活性下降是肝硬化形成的主要原因〔22〕。MMPs是降解細胞外基質的蛋白水解酶，其中，MMP13是主要的間質性膠原酶，是除中性粒細胞膠原酶外唯一特異性分解肝臟膠原蛋白的MMP。TIMPs是MMPs的主要特異性抑制物，目前發現肝內主要存在TIMP1和TIMP2。在病理狀下，其中TIMP1表達增強更為顯著，而肝纖維化時MMP13的活性主要受TIMP1抑制。本實驗結果表明，MMP13及TIMP1在0 w組動物肝組織少量表達，隨飼喂延長MMP13表達雖有降低，TIMP1表達增強更為顯著，二者平衡被破壞。大量TIMP1的出現使MMP13失去活性，致使細胞外基質成分降解減少，沉積增多，促進了肝纖維化的發展，形成肝硬化。

NAFLD發展到肝硬化是多方面原因造成的，氧化應激和脂毒性對線粒體損傷是NAFLD發展的關鍵作用〔23〕。課題組前期對沙鼠NAFLD模型的研究發現其肝臟存在超氧化物歧化酶(SOD)活性下降及游離脂肪酸在肝臟的堆積〔18〕。肝游離脂肪酸和膽固醇積累引起細胞損傷。在氧化應激條件下，過量的膽固醇會自動氧化生成氧甾醇。肝臟中游離脂肪酸和非酶促氧甾醇協同促進NAFLD的發生發展，損害線粒體功能、能量平衡和對慢性損傷的修復〔24〕。研究表明NASH患者存在肝細胞線粒體超微結構的損傷，且肝臟脂質含量與線粒體損傷密切相關。沙鼠模型存在SOD降低等氧化應激〔18〕，肝硬化時發生了細胞凋亡，推測氧化應激誘導的線粒體DNA損傷最終導致肝細胞凋亡。細胞凋亡及星狀和庫普弗細胞生成的細胞因子進一步增強了纖維化的變化，促進了疾病的發展。

肝臟近中央靜脈的肝腺泡Ⅲ帶細胞由于再生能力弱，營養條件差，肝損傷時往往最先出現腺泡Ⅲ帶細胞的變性壞死。與人類疾病相似，模型脂質聚集首先發生在肝腺泡Ⅲ帶細胞。本實驗還觀察到模型氣球樣病變、炎細胞浸潤，乃至后期出現的肝纖維化，也都首先出現在肝腺泡Ⅲ帶細胞。對NAFLD各個病理階段的治療與預防中，應先考慮對肝腺泡Ⅲ帶細胞的保護和干預。