酸柏梔油軟膠囊對2型糖尿病腎病大鼠的作用

吉金山 張正祥 李寶莉 張欣 曹凈 趙隆 王清清 鄧飛龍

(延安大學醫學院 1預防教研室，陜西 延安 716000；2藥理教研室；3 2016級本科生；4 2018級本科生；5 2017級本科生)

慢性腎病(CKD)的存在和嚴重程度是糖尿病患者不良預后的重要提示因素〔1〕，糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者最常見的并發癥之一，也是導致終末期腎病(ESRD)的主要原因，有20%～40%的2型糖尿病患者會發生腎臟疾病〔2〕，我國ESRD中DN患者僅次于腎小球腎炎〔3〕。由于長期的高血糖和糖尿病狀態導致腎小球、腎小管或腎間質受損從而引起DN〔4〕，這種腎損傷在早期是可逆的，但一旦腎病變明顯，就變得不可逆，最終發展為ESRD〔5〕。因此，早期DN的治療對于改善糖尿病患者預后具有重要意義。酸柏梔油軟膠囊具有很好的降血脂〔6〕、抗氧化作用〔7〕。本研究主要探討酸柏梔油軟膠囊對于DN大鼠的改善作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只4周齡雄性SPF級SD大鼠，體重(173.12±4.33)g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，許可證號SCXK(陜)2017-003。

1.2試劑與儀器 酸棗仁油購自陜西旭煌植物科技發展有限公司，柏子油和梔子油由廣西山云生化科技有限公司提供。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，使用時以0.1 mol/L pH4.2無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成濃度為1%的STZ溶液，即用即配。鹽酸二甲雙胍片(購自延安大學附屬醫院藥房)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，酶標儀(美國Bio Tek公司)，稱量臺，血糖檢測儀(美國強生公司)，全自動生化分析儀(西門子2400)。

1.3DN模型建立方法 采用高糖高脂飼料聯合小劑量STZ法，該法制備的模型具有典型的DN病變特點，主要表現為顯著的蛋白尿、腎臟肥大及腎組織細胞外基質積聚明顯，適合糖尿病及其并發癥的研究〔8〕。所有動物飼養于延安大學醫學院實驗動物中心，溫度22～27℃，濕度45%～55%，12 h交替照明。大鼠自由飲水、進食，每周稱量1次體重。適應性喂養3 d后，按體重隨機分為正常對照組(10只)和模型組(50只)，正常對照組給予常規飼料喂養，模型組給予高糖高脂飼料(常規飼料66.5%+20%蔗糖+10%豬油+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽)〔9〕。喂養6 w后，禁食不禁水12 h，空腹注射STZ 30 mg/kg，正常對照組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。注射以后隨時觀察大鼠狀態，防止低血糖死亡。72 h后，尾尖采血測空腹血糖，以>16.7 mmol/L即為2型糖尿病模型建立。2 w后用代謝籠收集兩組大鼠24 h尿液，檢測24 h尿白蛋白，以≥20 mg/24 h即為DN模型制備完成〔10〕。

1.4實驗動物分組及干預方法 未造模大鼠10只為正常對照組，成模后大鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組、酸柏梔油軟膠囊高劑量組、酸柏梔油軟膠囊中劑量組、酸柏梔油軟膠囊低劑量組。每天固定時間按1 ml/100 g劑量灌胃，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予鹽酸二甲雙胍(400 mg/kg)、干預組分別給予酸柏梔油軟膠囊0.450 g/100 g、0.180 g/100 g、0.072 g/100 g灌胃〔6〕，每天1次，連續灌胃8 w。

1.5標本收集 干預8 w后分別用代謝籠收集大鼠24 h尿液，離心后，-20℃保存。用10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，4℃，3 000 r/min離心15 min，取血清保存于-80℃冰箱中待測。

1.6血、尿生化指標檢測 運用血糖檢測儀測定空腹血糖，運用全自動生化分析儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C，BUN、Scr的檢測按照試劑盒說明書操作。

1.7統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、Kruskal-WallisH檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況 成模初期，模型組生長發育良好，與正常對照組大鼠相比毛色變化不明顯，隨后開始出現飲食、飲水量和尿量增多，體重降低，毛色暗淡發黃。隨著干預的進行，模型組大鼠生長發育形態開始出現差異：正常對照組大鼠活潑好動，模型對照組大鼠精神頹靡，極度消瘦，毛色粗糙暗淡發黃，飼養箱內終日不凈，排泄物較其他組多且酮臭味重，各干預組大鼠毛發較模型對照組有光澤、精神狀態佳。實驗期間有9只大鼠死亡。

2.2各組大鼠體重比較 注射STZ前，經高糖高脂飼料喂養實驗組大鼠體重顯著高于正常對照組(P<0.05)；在干預4 w末，各干預組體重均顯著低于陽性對照組(P<0.05)，酸柏梔油軟膠囊高劑量組體重顯著高于模型對照組(P<0.05)，而酸柏梔油軟膠囊中、低劑量組體重與模型對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；在干預8 w末，各干預組體重均顯著高于模型對照組(P<0.05)，酸柏梔油軟膠囊高劑量組體重與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，而酸柏梔油軟膠囊中、低劑量組顯著低于陽性對照組(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠體重比較

與正常對照組相比:1)P<0.05；與模型對照組相比:2)P<0.05；與陽性對照組相比:3)P<0.05；下表同

2.3各組空腹血糖比較 注射STZ前，經高糖高脂飼料喂養實驗組大鼠血糖顯著高于正常對照組(P<0.05)；在干預4 w末，模型組及酸柏梔油軟膠囊低劑量組血糖顯著高于陽性對照組(P<0.05)；在干預8 w末，酸柏梔油軟膠囊高、中劑量組及陽性對照組血糖顯著低于模型組(P<0.05)，酸柏梔油軟膠囊高劑量組血糖與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，酸柏梔油軟膠囊中、低劑量組血糖顯著高于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組空腹血糖比較

2.4各組血清HDL-C、LDL-C、TG、TC水平比較 酸柏梔油軟膠囊高劑量組及陽性對照組HDL-C水平顯著高于模型對照組(P<0.05)，酸柏梔油軟膠囊高劑量組HDL-C水平與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，酸柏梔油軟膠囊中、低劑量組的HDL-C水平與陽性對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；酸柏梔油軟膠囊高、中劑量組及陽性對照組LDL-C水平均低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而酸柏梔油軟膠囊的高劑量組LDL-C水平與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；酸柏梔油軟膠囊各組及陽性對照組的TG水平均低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；酸柏梔油軟膠囊高、中劑量組TC水平均低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清HDL-C、LDL-C、TG、TC水平比較

2.5各組Scr、BUN水平比較 酸柏梔油軟膠囊組Scr水平均顯著低于模型對照組(P<0.05)，但顯著高于陽性對照組(P<0.05)；酸柏梔油軟膠囊高、中劑量組的BUN水平顯著低于模型對照組(P<0.05)，且高劑量與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Scr、BUN水平比較

3 討 論

酸柏梔油軟膠囊是由酸棗仁油、梔子油、柏子油以3∶3∶1壓制而成，酸棗仁乃鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，柏子仁為柏科綠喬木植物側柏的干燥成熟種仁，梔子系茜草科植物梔子的干燥成熟果實，其主要成分為油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸和維生素E〔11〕。本研究表明酸柏梔油軟膠囊對于DN大鼠的血糖、血脂和腎功能改善具有積極作用。

本研究結果表明酸柏梔油軟膠囊高劑量組能有效改善DN大鼠癥狀，改善DN大鼠的糖代謝紊亂，降低血糖值。糖尿病患者在持續高糖狀態下，氧自由基生成增多，抗氧化能力下降，產生氧化應激，促進DN的發生、發展〔12〕。腎組織氧供豐富，活性氧產生較多，同時腎組織中抗氧化酶發生糖化或氧化，使腎組織抗氧化能力明顯降低造成氧化應激狀態〔13〕。維生素E是一類具有抗氧化作用的營養素，定位于細胞膜并且具有較強的脂溶性，能夠增強細胞的抗氧化力并保護細胞免受氧自由基的損傷〔14〕。研究證實維生素E可以通過降低氧化應激水平、調節過氧化物酶體增生激活型受體(PPAR)-α和PPAR-γ的表達、改善脂質代謝來減輕糖尿病患者的胰島素抵抗，發揮抗糖尿病作用〔15〕，有臨床研究已經報道了糖尿病患者在接受高劑量維生素E的治療后腎功能得到了改善〔16〕。同時，酸棗仁的藥理成分主要包括生物堿、皂苷和黃酮，具有良好的抗氧化活性〔17〕。這都有助于酸柏梔油軟膠囊發揮降血糖和改善腎功能的作用。

本研究結果表明酸柏梔油軟膠囊高劑量可以有效改善DN大鼠的脂代謝紊亂，降低LDL-C、TG、TC水平，升高HDL-C水平，這與前期的研究結果一致〔7〕。動物實驗表明，膳食飽和脂肪酸可降低胰島素敏感性，而膳食長鏈n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)可增強胰島素敏感性、防止胰島素抵抗的發生〔18〕，通過給小鼠喂以多不飽和脂肪酸2 w后血清膽固醇(CH)和TG水平分別降低50%和60%〔19〕。研究認為，PURA可能是通過參與脂代謝酶、LDL受體途徑、PPAR途徑等機制發揮調節血脂的作用〔20〕。

各干預組的Scr、BUN水平均低于模型對照組，表明酸柏梔油軟膠囊可以改善DN大鼠的腎功能。中藥酸棗仁的主要成分之一是酸棗仁皂苷A，有研究表明：給予糖尿病模型大鼠酸棗仁皂苷A后，腎小球細胞凋亡明顯減少，同時腎組織的Bcl-2蛋白表達顯著增加，Bax、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶9和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3蛋白表達顯著減少，提示酸棗仁皂苷A可能通過抑制凋亡蛋白Bax的活性和增強Bcl-2的活性，從而抑制腎組織細胞的凋亡，發揮保護腎臟的作用〔21〕。此外，正常大鼠腹腔注射酸棗仁皂苷后，TC、LDL-C含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高〔22〕，這也與本研究中觀察到的結果一致。