麥冬多糖對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導心肌細胞凋亡的影響

陳碧珊 吳紅衛(wèi) 李艷 張濱 沈勇剛

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院 1藥學部臨床藥學科,廣東 廣州 510000；2康復科)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是TGF-β超家族中活性最強的亞型，參與細胞增殖凋亡、免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)生、創(chuàng)傷修復等的調(diào)控〔1，2〕。研究表明，TGF-β1參與心肌病、心肌梗死后心力衰竭、高血壓心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，且可引起心肌細胞凋亡〔3，4〕。目前也有大量研究使用TGF-β1建立心肌細胞凋亡模型〔5，6〕。麥冬為常用的滋陰中藥，主要化學成分為多糖類和皂苷，麥冬多糖(MDG-1)是從麥冬中分離純化后得到的均一分子量的β-D-果聚糖〔7〕。研究表明，MDG-1對心肌缺血損傷具有改善作用〔8〕，但MDG-1對TGF-β1誘導的心肌細胞凋亡的影響及作用機制尚未明確。本研究以大鼠心肌細胞H9c2為研究對象，使用TGF-β1建立心肌細胞損傷模型，旨在觀察MDG-1對TGF-β1誘導的心肌細胞凋亡的影響，并進一步探究其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料及主要試劑和儀器 大鼠H9c2心肌細胞購自中科院上海細胞研究所細胞庫。噻唑藍(MTT)試劑購自美國Sigma；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；增殖細胞抗原(PCNA)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、p53、核因子(NF)-κB p65、KB抑制蛋白激酶(IKK)α和β-catenin抗體均購自美國CST；Multiskan酶標儀購自美國Thermo；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD。

1.2細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細胞，培養(yǎng)條件：37℃、CO2體積分數(shù)5%、適度飽和。實驗選擇生長良好的對數(shù)期細胞。

1.3分組及處理 H9c2心肌細胞分為對照組、TGF-β1組和MDG-1組。對照組及TGF-β1組均加入DMEM培養(yǎng)液，MDG-1組加入100 mg/L MDG-1，每組設(shè)置6個復孔，于37℃恒溫、飽和濕度及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄掉上清，對照組加DMEM培養(yǎng)液，TGF-β1組和MDG-1組加入20 ng/ml TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細胞，用于實驗研究。

1.4MTT檢測細胞活力 以1×105個/ml的密度接種H9c2心肌細胞于96孔板，每孔加入細胞懸液200 μl，于37℃、飽和濕度及5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁后，棄去上清，按照1.3方法處理細胞，收集處理后繼續(xù)培養(yǎng)12 h的3組細胞，加入MTT溶液，每孔20 μl，于37℃恒溫、飽和濕度及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，酶標儀于490 nm處測定各孔的吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細胞凋亡率。以3×105個/ml的密度接種生長至對數(shù)期的H9c2心肌細胞于96孔板，分組及處理方法同1.3，收集處理至規(guī)定時間的3組細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，胰酶消化后收集細胞。用400 μl 1倍結(jié)合緩沖液重懸細胞，細胞懸浮液中加入Annexin V-FITC染色液5 μl，混勻后避光4℃冰箱孵育15 min，再加入PI染色液10 μl，混勻后避光4℃冰箱孵育5 min，上機前再加入300 μl 1倍結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.6流式細胞術(shù)檢測活性氧(ROS)水平 收集按照1.3分組處理12 h的3組細胞，用終濃度為10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)液懸浮細胞，于37℃條件下孵育細胞20 min，通過流式細胞儀檢測。由于ROS探針DCFH-DA本身是無熒光，但能穿過細胞膜，且ROS可以將細胞內(nèi)不含有熒光的DCFH氧化為產(chǎn)生熒光的DCF，因此通過檢測DCF的熒光強度可間接反映細胞內(nèi)ROS水平。實驗重復3次。

1.7Western印跡 收集按照1.3分組處理12 h的3組細胞，適量細胞裂解液提取細胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法進行蛋白定量，每孔道上樣等量總蛋白，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠進行蛋白分離，然后將蛋白通過電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，加一抗(1∶1 000稀釋的PCNA、Bcl-2、p53、NF-κB p65、IKKα和β-catenin抗體)，4℃孵育過夜，洗膜，加二抗，室溫孵育1.5 h，用電化學發(fā)光(ECL)進行顯色。以GAPDH為內(nèi)參，用gel pro4.0軟件分析各目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值，其比值即為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞活動比較 TGF-β1組細胞活力(A值：0.302±0.025)顯著低于對照組(0.687±0.054，P<0.05)，MDG-1組(0.529±0.047)顯著高于TGF-β1組(P<0.05)。3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=58.622，P=0.000)。

2.2各組細胞凋亡率比較 TGF-β1組細胞凋亡率(30.26%±3.05%)顯著高于對照組(3.12%±0.03%，P<0.05)，MDG-1組(10.54%±0.98%)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=172.525，P=0.000)，見圖1。

2.3各組ROS水平比較 TGF-β1組ROS水平(熒光強度：86.42±3.26)顯著高于對照組(32.18±1.57，P<0.05)，MDG-1組(53.55±2.41)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=355.472，P=0.000)。

2.4MDG-1對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 TGF-β1組PCNA和Bcl-2蛋白表達顯著低于對照組，p53蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)；MDG-1組PCNA和Bcl-2蛋白表達顯著高于TGF-β1組，p53蛋白表達顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，見圖2，表1。

2.5MDG-1對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞Wnt/β-catenin信號及NF-κB信號的影響 TGF-β1組β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)，MDG-1組顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，見圖3，表2。

圖1 MDG-1對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響

圖2 MDG-1對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞PCNA、Bcl-2和p53蛋白表達的影響

表1 各組PCNA、Bcl-2和p53蛋白表達

與對照組比較：1)P<0.05；與TGF-β1組比較：2)P<0.05;下表同

圖3 MDG-1對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表達的影響

表2 各組β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表達

3 討 論

心腦血管疾病具有致殘率高、復發(fā)率高和死亡率高的特點，且有較多的并發(fā)癥，嚴重威脅人類的生命健康〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞除進行自身的分裂、再生外，還參與病變組織修復及心臟自穩(wěn)態(tài)的維護〔10〕。在多種心血管疾病中，心肌細胞的凋亡貫穿于整個過程，因此，有效降低心肌細胞凋亡對于心血管疾病治療具有重要意義。我國中藥資源豐富，植物多糖在抗腫瘤、抗衰老、免疫活性調(diào)節(jié)、心血管疾病等方面均發(fā)揮重要作用。目前對MDG-1在心血管疾病方面的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，MDG-1可改善心肌缺血造成的損傷〔8〕，20～200 mg/L MDG-1對心肌細胞無明顯的細胞毒性〔11〕。因此，本研究選擇100 mg/L的MDG-1。心肌細胞凋亡可能是非缺血和(或)缺血性心肌病患者心肌細胞死亡的一種形式，心肌細胞一旦發(fā)生凋亡，原有的心肌將被膠原纖維取代，繼而引起心室重構(gòu)、心肌肥厚、心肌纖維化等，最終導致心力衰竭。研究表明，在心力衰竭過程中TGF-β1表達急劇增加，且在TGF-β1刺激下可引起心肌細胞凋亡〔12〕。因此，在多種心血管疾病研究中使用TGF-β1建立心肌細胞損傷模型。本研究結(jié)果顯示，MDG-1可逆轉(zhuǎn)TGF-β1對心肌細胞活力的抑制作用，抑制由TGF-β1引起的心肌細胞凋亡?？梢?，MDG-1對心肌凋亡具有抑制作用。

氧化應(yīng)激是生物體一個正常的生命活動，ROS是重要的氧化應(yīng)激水平反應(yīng)指標。有研究表明，ROS的過度產(chǎn)生可激活下游的一些促進細胞重構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子及信號激酶，也可引起心肌纖維細胞的增生，使在細胞外的基質(zhì)金屬蛋白酶激活，最終導致心肌基質(zhì)重構(gòu)〔13，14〕。也有研究指出，抑制ROS水平可降低心肌細胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDG-1可降低由TGF-β1引起的心肌細胞ROS水平的升高，提示MDG-1降低心肌細胞凋亡機制可能與降低氧化應(yīng)激有關(guān)。Wnt/β-catenin信號是Wnt信號中的經(jīng)典信號通路，參與調(diào)控細胞增殖、凋亡、生長發(fā)育及分化等〔16〕。研究表明，Wnt/β-catenin信號在健康成人心臟中是沉默的，而在多種心血管疾病中該信號被持續(xù)激活，從而可引起細胞凋亡〔17〕。NF-κB是一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細胞凋亡。有研究表明，在多種心血管病中該信號通路被活化，可引起細胞凋亡〔18〕；也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信號和NF-κB信號可通過對下游的增殖凋亡相關(guān)的PCNA、p53、Bcl-2、Bax的調(diào)節(jié)影響心肌細胞增殖和凋亡〔19～21〕。本研究結(jié)果提示，MDG-1對心肌細胞活力及凋亡的影響與抑制Wnt/β-catenin信號和NF-κB信號有關(guān)。

綜上，MDG-1可增強心肌細胞活力，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能與降低細胞內(nèi)ROS水平及抑制Wnt/β-catenin和NF-κB信號有關(guān)。本研究僅為細胞水平的檢測，且未進行體內(nèi)實驗，因此還需進一步的證實。