氮、磷、鉀脅迫對甘蔗生長及固氮酶活性的影響

黃曉財，胡浩南，李欣欣，敖俊華1,*，廖 紅

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2華南農業大學，廣東廣州510642；3福建農林大學根系生物學研究中心，福建福州350002)

0 引言

甘蔗是我國重要的糖料和能源作物，在人們日常生活和國家經濟發展中起著舉足輕重的作用。氮(N)、磷(P)和鉀(K)是農業肥料三要素，是植物生長發育所必需的大量營養元素。每生產1 t甘蔗需要獲取1.5～2 kg的N、1～1.5 kg的P以及2～2.5 kg的K[1]。N、P、K 的缺乏會嚴重抑制甘蔗生長、降低其生產力[2-3]。例如，缺氮能使甘蔗葉片黃化，植株矮小[3]；缺磷使甘蔗葉片花青素積累，抑制蔗莖及根系生長，影響光合導致糖分含量下降[4]；缺鉀使甘蔗中脈變紅，阻礙光合作用，降低轉化酶活性，降低分蘗數，植株瘦弱[5]。為提高或維持甘蔗產量，毋庸置疑，施肥是最直接、最快速的手段。然而，近年來由于不合理或過度施肥，不僅增加了農業成本而且對人類賴以生存的生態環境造成嚴重破壞[6-7]。因此，研究不同施肥條件對甘蔗生長的影響，挖掘植物自身潛力結合合理的施肥措施，是提高甘蔗產量和品質的有效途徑。

甘蔗是重要的聯合固氮作物[8]。研究表明，某些甘蔗品種可從生物固氮系統中獲取所需氮量的60%～70%[9]；同時，接種固氮菌，能顯著提高甘蔗根及地上部的氮含量和生物量[10-11]，這暗示了聯合固氮作用在甘蔗生產及可持續生態農業中的重要性。內生固氮菌種類較多，且能夠定殖于甘蔗不同組織部位，包括根、莖和葉[12-14]。不同組織部位中固氮菌的固氮酶活性存在明顯差異，固氮酶活性亦是衡量生物固氮效率較為重要的指標之一。然而，關于不同施肥處理對甘蔗固氮酶活性的影響的報道比較少見。本研究利用土培法，比較分析了粵糖93-159和 ROC22在不同施肥條件下的營養生長及固氮酶活性的變化，以期為甘蔗營養研究、養分管理及聯合固氮系統與養分相關聯的基礎研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植株材料

供試甘蔗品種：ROC22、粵糖93-159。ROC22是臺灣糖業研究所利用母本ROC5和父本69-463培育而成，于1998年引入大陸并大面積種植，該品種中熟、高糖，現為我國種植面積最大的甘蔗品種；粵糖 93-159由廣州甘蔗糖業研究所利用母本粵農73-204和父本CP72-1210育成，該品種特早熟高糖，在我國蔗區廣泛種植。

挑選長勢一致的甘蔗種莖，斬成長短一致的單芽苗，經300倍多菌靈稀釋液浸泡5 min后，擺放于裝有河沙的育苗盤內，待第4片真葉完全展開時，作為供試種苗。

1.1.2 供試土壤

試驗土壤取自粵西蔗區，土壤類型為磚紅壤，土壤pH 4.9，有機質20.11 g/kg，全氮0.62 g/kg，全磷0.50 g/kg，全鉀2.67 g/kg，堿解氮33.30 mg/kg，速效磷≤5.00 mg/kg，速效鉀35.22 mg/kg。

1.1.3 試驗種植槽

試驗種植槽為1 m×1 m×1.2 m (長×寬×深)的水泥槽，每槽裝供試土壤1 m3，移栽甘蔗種苗12株。肥料施用采用面積換算，施用量為農民田間常規施用量的 2.5倍，農民田間常規施用量為 N 498 kg/hm2、P2O5324 kg/hm2、K2O 540 kg/hm2。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同甘蔗品種的施肥處理

試驗設 4個施肥處理，3次重復。施肥處理包括：不施氮肥處理(-N)，即磷肥(P2O5)81.00 g/槽和鉀肥(K2O)135.00 g/槽；不施磷肥處理(-P)，即氮肥(N)124.20 g/槽和鉀肥(K2O)135.00 g/槽；不施鉀肥處理(-K)，即氮肥(N)124.20 g/槽和磷肥(P2O5)81.00 g/槽；氮磷鉀處理(NPK)，即氮肥(N)124.20 g/槽、磷肥(P2O5)81.00 g/槽、鉀肥(K2O)135.00 g/槽。磷肥為過磷酸鈣(P2O512%)，在基肥時一次性施入；氮肥為尿素(N 46%)，鉀肥為氯化鉀((K2O 60%)，分基肥和分蘗期追肥2次施用，2個時期施用比例分別為30%和70%。

供試甘蔗于2016年1月份移植，9月中旬測試甘蔗株高、莖徑并取樣，每株甘蔗從肥厚帶處剪取+4葉(甘蔗最高可見肥厚帶往下數的第4片葉，依此類推)和植株新鮮根系測定其固氮酶活性。

1.2.2 固氮酶活性測定

參考Kirchhof等[15]培養基方法，利用LGI培養基測定甘蔗固氮酶活性。其成分主要包括：K2HPO40.20 g/L、KH2PO40.60 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、CaCl2·2H2O 0.02 g/L、NaMoO4·2H2O 0.002 g/L、FeCl3·6H2O 0.01 g/L、蔗糖 100.00 g/L。

參照 Roesch等[16]及桂意云等[12]方法，分別將不同品種甘蔗的根，+4葉用自來水及無菌水沖洗后，再用剪刀切碎混均勻，并稱取1 g左右樣品，轉入60 mL培養瓶中，分別加入10 mL上述LGI培養液，進行培養48 h后，用針筒抽出1 mL氣體并同時注入等體積的乙炔繼續培養 24 h，隨后加入50%三氯乙酸1 mL終止反應，并使用氣相色譜儀測定形成乙烯的量。每個部位3個生物學重復。以nmol(C2H4)·g-1(Fw)·h-1表示固氮酶活性大小，計算公式如下：

其中，C：標準曲線上對應的乙烯濃度(g/L)；V1：瓶子的體積(L)；V2：裝樣品所占用的體積(L)；M：乙烯分子量；FW：樣品鮮重(g)；H：加入乙炔后培養的時間(h)。

1.2.3 N、P、K濃度測定

將不同處理的甘蔗+2葉105℃殺青30 min后，75℃恒溫烘干粉碎。氮、磷使用連續流動分析儀(型號為SAN++，產自荷蘭)測定；K使用火焰分光光度計測定。

1.3 數據分析

應用Microsoft Excel 2007進行數據計算，采用SigmaPlot進行作圖，SPSS 16.0用于數據統計分析。

圖1 不同施肥處理對不同甘蔗品種生長的影響

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對甘蔗生長的影響

2.1.1 不同施肥處理對甘蔗株高和分蘗直徑的影響

分析粵糖93-159和ROC22在不同施肥條件下的株高及莖徑的變化，結果如圖1所示，不施氮肥(-N)顯著抑制了甘蔗生長，粵糖 93-159和 ROC22的株高(圖1A)和莖徑(圖1B)均明顯低于氮磷鉀處理(NPK)，粵糖 93-159的株高和莖徑分別降低了74.49%、17.48%，ROC22降低了78.28%、68.75%；在不施磷肥(-P)處理下，粵糖 93-159的株高顯著低于NPK，而-P并未影響ROC22的株高以及2個甘蔗品種的莖徑；不施鉀肥(-K)處理的 2個甘蔗品種株高和莖徑與NPK處理具有相似的趨勢，品種內無顯著差異。另外，無論哪種施肥條件，ROC22的株高要顯著高于粵糖93-159(圖1A)，而-N處理下，粵糖93-159的莖徑要明顯高于ROC22。通過不同施肥條件的比較分析，說明缺氮會嚴重抑制甘蔗生長發育。

2.1.2 不同施肥處理對不同甘蔗有效莖數的影響

不同施肥處理對甘蔗有效莖數的影響結果分析表明(表 1)：-N和-P顯著減少了不同甘蔗品種的有效莖數。在-N條件下，粵糖93-159和ROC22的有效莖數分別降低了 78.0%和 64.7%；在-P條件下，分別降低了 68.3%和 58.8%。在-K條件下，粵糖93-159的有效莖數降低了41.5%，而對ROC22無顯著影響。此外，在同一施肥水平下，粵糖93-159的有效莖數均要多于ROC22，暗示了粵糖93-159可能具有較高的氮磷鉀養分效率。

表1 不同甘蔗品種在不同施肥條件下的有效莖數

2.2 不同施肥處理下甘蔗葉片N、P、K濃度的變化

甘蔗+2葉為甘蔗最高可見肥厚帶往下數的第2片葉，其為甘蔗的重要功能葉片。通過分析不同施肥條件下甘蔗+2葉片的 N、P、K濃度，結果發現不同施肥處理對不同甘蔗品種的養分濃度影響不同。-N處理提高了粵糖93-159和ROC22的+2葉N濃度(圖 2A)，與對照相比，分別增加了 45.4%和15.3%。粵糖93-159在-P和-K條件下，甘蔗+2葉N濃度與對照相比，表現相反的差異：-P處理下，其+2葉N濃度降低了21.2%，-K條件下的N濃度提高了28.8%；然而，ROC22在-P和-K處理下+2葉的N濃度與NPK相比無顯著差異。

不施磷肥顯著降低了甘蔗+2葉的 P濃度(圖2B)。與對照相比，粵糖93-159和ROC22的+2葉P濃度分別降低了58.7%和28.0%。而不施氮肥時，顯著增加了2種甘蔗品種+2葉的P濃度，粵糖93-159的P濃度較對照增加了211.1%，ROC22的P濃度較對照增加了 30.3%。然而，不施鉀肥處理下，粵糖93-159和ROC22的+2葉P濃度與對照相比，無明顯差異。

由圖2C可知，不施鉀肥條件下，ROC22+2葉的K濃度較對照降低了50.2%；而粵糖93-159的+2葉K濃度雖然存在下降趨勢，但與 NPK相比無顯著差異。然而，在-N條件下，粵糖93-159和ROC22的+2葉 K濃度均顯著增加，分別提高了 46.3%和32.8%。在不施磷肥條件下，2種甘蔗品種+2葉的K濃度與對照相比，無顯著差異。

2.3 不同施肥處理對甘蔗根和葉固氮酶活性的影響

利用 LGI培養基培養不同品種甘蔗根系及+4葉，并測定其固氮酶活性。結果如圖 3A所示，不施氮肥時，顯著提高ROC22根系的固氮酶活性，而粵糖93-159根系的固氮酶活性提高不明顯。在不施磷、鉀肥及對照條件下，ROC22的固氮酶活性均較低；粵糖93-159在不同施肥條件下根系的固氮酶活性相對較高，總體變化趨勢是-N＞NPK＞-K＞-P。

在+4葉中，粵糖 93-159的固氮酶活性在不施氮肥條件下最高，為 302.27 nmol (C2H4)·g-1(Fw)·h-1；其次是不施磷和鉀肥處理，而對照條件下的固氮酶活性最低。然而，ROC22的+4葉固氮酶活性在不施磷肥條件下最高；不施氮肥亦能提高其固氮酶活性，比NPK提高了144.0%；不施鉀肥處理抑制了ROC22的固氮酶活性，NP較NPK降低了76.3%。說明，不同施肥條件對不同甘蔗品種的內生固氮菌菌落存在不同程度的調控，進而不同程度地影響了固氮酶活性。

3 討論與結論

甘蔗是高光效的 C4作物，生長周期長，生物量高，對養分需求大。眾所周知，氮、磷和鉀是植物生長發育所必需的大量營養元素。其中，氮是構成蛋白質的主要成分，是植物需求量最大的礦質養分；磷是細胞結構物質，是磷脂、核酸和核蛋白等的重要組分；鉀參與植物生理生化代謝過程，維持某些代謝酶的活性。然而，土壤養分有效性低往往是限制甘蔗產量的主要因素之一。挖掘作物自身潛力，結合合理施肥措施是提高產量經濟有效的策略。本研究設置了不施氮肥、不施磷肥、不施鉀肥和對照4個處理，分析了在不同處理下，不同甘蔗品種的生長及固氮酶活性變化。我們的結果顯示，在不施氮肥條件下，顯著抑制了粵糖 93-159和 ROC22的株高(圖 1A)、莖徑(圖 1B)及有效莖數(表 1)；不施磷肥處理，顯著抑制了不同甘蔗品種的株高(圖1A)和有效莖數(表1)，對甘蔗莖徑(圖1B)影響不大；不施鉀肥處理，除影響粵糖 93-159的有效莖數外，2種甘蔗的生長狀態與對照相比，無明顯差異。說明，甘蔗的生長依賴土壤氮、磷、鉀的供給；同時也暗示了，甘蔗本身可能對鉀具有一定的活化作用。

圖2 不同施肥處理對不同甘蔗品種+2葉中氮、磷及鉀濃度的影響

施肥不僅能影響植物本身生長發育過程，同時能改變土壤微生物群落[17]。甘蔗與固氮微生物形成的聯合固氮系統，受氮營養的調控作用，一般而言，低氮能促進生物固氮的發生[18]。同時，研究發現，田間氮肥用量的多少直接影響了內生固氮菌在甘蔗體內存在的數量，進而影響了固氮作用[19]。此外，接種內生固氮菌，能夠顯著提高植株根系和葉的氮含量，最終增加了甘蔗生物量[10-11]。我們的結果顯示，粵糖93-159和ROC22根系和+4葉中的固氮酶活性在不施氮肥條件下均較高(圖3)，說明缺氮促進了甘蔗聯合固氮細菌的定殖，進而使甘蔗葉片氮濃度在不施氮肥條件下最高(圖2A)。Panwar和Singh[20]發現，小麥接種固氮螺菌促進了根系生長，進而促進了對其他土壤礦質養分的吸收；在甘蔗中分離的大部分內生固氮菌，具有合成分泌 IAA、嗜鐵素和溶解無機磷等特性[21]。這暗示了，充分發揮聯合固氮作用對提高甘蔗營養高效的重要性。因此，本研究在不施氮肥條件下，甘蔗葉片的P和K濃度均比其他處理高。說明，充分發揮甘蔗聯合固氮作用不僅能增加植株對N的獲取，同時是提高甘蔗養分高效的重要策略，甘蔗的聯合固氮系統與土壤礦質養分息息相關。粵糖93-159和ROC22在不同施肥條件下，各有優勢。例如，ROC22的株高在本研究所設置的處理中均明顯高于粵糖93-159，而有效莖數表現出相反的結果；2個品種的固氮酶活性在不同施肥條件下也存在差異，研究結果可為甘蔗內生固氮菌與礦質養分的關系以及品種差異(選擇優勢品種) 的研究提供一定理論依據。

因此，通過研究結果表明：氮、磷、鉀是甘蔗與固氮微生物聯合固氮系統形成的重要調控因素。不施氮肥顯著抑制了甘蔗的生長發育，甘蔗株高、莖徑和有效莖數，但促進了甘蔗聯合固氮作用，顯著提高了根系和+4葉的固氮酶活性。不施磷肥顯著減少了甘蔗的有效莖數，并影響甘蔗的固氮酶活性和氮營養。

圖3 不同施肥處理對不同甘蔗品種根和葉固氮酶活性的影響