高頻電刺激對癲癇模型大鼠慢性期海馬苔蘚纖維出芽及癇性發作影響

洪全龍　陳圣根　黃文立　楊美青

【摘要】 目的：局部注射海人酸制作癲癇大鼠模型，研究局部高頻電刺激對癲癇大鼠苔蘚纖維出芽及癇性發作的影響。方法：海馬局部注射海人酸制作大鼠顳葉癲癇模型，選擇局部海馬癲癇灶進行高頻電刺激，選擇不同時間點，觀察大鼠癲癇發作特點及腦電變化，通過改良Timm染色法，觀察海馬病理改變。結果：行為和腦電變化，點燃大鼠行為學上可分三期，包括急性期、靜止期、慢性期，同時各個時期有相應的腦電特征表現。電刺激可減少慢性期大鼠癲癇發作的次數和癇性放電的次數（P<0.001）。病理改變，點燃后大鼠海馬Timm染色可見4 d時苔蘚纖維出芽開始出現，到14 d最明顯（P<0.01），Golijeh評分電刺激組較海人酸組低（P<0.05）。結論：局部高頻電刺激海馬能有效抑制海人酸癲癇模型大鼠的癲癇發作及癇性放電，抑制海馬苔蘚纖維出芽可能是高頻電刺激控制癲癇發作的作用機制之一。

【關鍵詞】 海人酸; 高頻電刺激; 顳葉癲癇; 苔蘚纖維出芽

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.05.002 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）05-000-04

The Effects of High Electrical Stimulation on Mossy Fiber Sprouting and Epileptic Seizure in the Hippocampus of Model Rat/HONG Quanlong，CHEN Shenggen，HUANG Wenli，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（5）：-6

【Abstract】 Objective：In this study，the effects of electrical stimulation on mossy fiber sprouting and epileptic seizure in chronic epileptic rats were investigated by establishing the model of chronic epileptic rats with Kainic acid.Method：The temporal lobe epilepsy models were established with unilateral Kainic acid injections.Local hippocampal epileptic foci were selected for high-frequency electrical stimulation.Different time points were selected to observe the seizure characteristics and EEG changes in rats，the pathological changes of hippocampus was investigated by Timm staining.Result：Behavior and EEG，the behavior of ignited rats can be divided into three phases，including acute phase，quiescent phase and chronic phase，in the three periods，the characteristic of EEG were recorded.HFS may reduce the spontaneous recurrent seizures and epileptic discharge in the chronic phase（P<0.001）.Pathology，the Timm staining of the rat hippocampus showed that the mossy fiber sproutings evidence was found at 4 days following induction of SE，and was vigorous at 14 days（P<0.01）.IN the Golijeh score，electrical stimulation group was lower than the KA group（P<0.05）.Conclusion：High electrical stimulation of hippocampus can effectively inhibit seizures and epileptic discharge in rats with Kainic acid epilepsy.Inhibition of hippocampal mossy fiber sprouting may be one of the mechanisms of high-frequency electrical stimulation to control epileptic seizures.

【Key words】 Kainic acid; High electrical stimulation; Temporal lobe epilepsy; Mossy fiber sprouting

First-authors address：Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

在癲癇治療中，有30%的患者藥物控制不理想，發展成難治性癲癇[1]。腦深部電刺激術作為難治性癲癇治療有效手段，目前機制還不清楚，苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MSF）被認為顳葉癲癇一個重要的病理學特點，這些異常突觸建立起海馬興奮環路，對異常放電的產生及擴散起到了易化作用[2]。本研究采用海馬區局部注射海人酸，建立顳葉癲癇模型;電刺激（130 Hz）局部海馬癲癇灶，觀察和對比不同時間點大鼠行為、腦電和海馬病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：購自中國上海斯萊克實驗動物有限公司SD清潔級雄性成年大鼠（體重250～300 g，10～13周齡）。

1.2 實驗方法及步驟

1.2.1 動物分組 將大鼠分為電刺激組（n=25）、點燃組（n=40）、電極植入組（n=25）、空白組（n=8）。共98只大鼠納入實驗。

電刺激組：注射海人酸后植入電極，大鼠癲癇發作大于Ⅳ級，且發作大于3次，腦電圖描記到有癇性放電，給予電刺激治療。點燃組：注射海人酸后未植入電極，大鼠癲癇發作大于Ⅳ級，且發作大于3次，腦電圖描記到有癇性放電。電極植入組：相同部位植入電極，注入生理鹽水，連接刺激器，不予刺激。空白組：正常雄性成年大鼠。

1.2.2 模型的建立及電極植入 術前1 h，配制海人酸（0.4 μg/μl），

選擇右側海馬腹后部CA3區，取海人酸1.0 μl（電極植入組抽取超純水1.0 μl），緩慢注射，沿注射孔道，將刺激電極緩慢植入，定位于右側海馬CA3區。同側額區（P 2.5 mm，L 2.0 mm，D 0.5 mm）作為記錄電極位置，枕骨棘中央作為參考電極。牙托粉和502膠水固定。單籠飼養。

1.2.3 大鼠行為學觀察 按Racie癲癇行為分級法[3]，術后14 d每日記錄點燃大鼠發作級別及發作次數。納入實驗點燃大鼠標準：確認有癲癇發作Ⅳ級以上發作連續出現3次以上。

1.2.4 視頻腦電圖描記皮層腦電 使用常規腦電圖記錄癇性放電次數，描記時間在術后1、4、7、14 d進行，電極放置位置如上述。

1.2.5 電刺激干預 使用YC-2型程控電刺激器;刺激參數：強度500 μA，波寬0.05 ms，頻率130 Hz;刺激時間30 min，最長14 d。

1.2.6 組織取材 點燃組（n=10）和空白組（n=2）1、4、7、14 d每個時間段隨機取材組織制備，其中一組用于病理學觀察，另一組取材備用。電刺激組和電極植入組1、4、7 d

（n=5）時取材冷藏備用，14 d（n=10）隨機取材組織制備，其中一組組織制備用于病理學觀察，另一組組織取材冷藏備用。病理觀察用改良Timm染色，判斷標準依據Golijeh評分[4]，Golijeh評分依據Timm顆粒分布，從無到致密共分為0～Ⅴ級。

1.3 統計學處理

分析采用SPSS 19.0統計軟件包。實驗數據經檢驗符合正態分布和方差齊性，采用均值士標準差（x±s），組間采用單因數方差分析;若實驗數據不符合正態分布和方差齊性，采用非參數檢驗。等級資料采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學觀察及視頻腦電圖記錄大鼠腦電變化

電極植入組和空白組未見癲癇發作。點燃組點燃的大鼠行為癥狀表現可分為急性期、靜止期和慢性期。同時記錄到不同時期的腦電特點（如圖1～圖4），這與人類顳葉癲癇的臨床病程特點相似。結果發現電刺激組發作及癇性放電次數較點燃組少（P<0.001），見表1。

2.2 Timm 染色觀察大鼠海馬苔蘚纖維出芽

2.2.1 點燃組致癇后1、4、7、14 d 不同時間點苔蘚纖維出芽變化觀察 如圖5，在致癇后隨著時間延長，可觀察到齒狀回內分子層的MFS顆粒由零星分布到濃染成層狀，14 d 時尤為明顯。

2.2.2 苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MFS）不同時點半定量分析 比較不同時間段Golijeh評分，詳見表2。結果提示點燃后1～4 d MFS較稀疏（Golijeh評分0～Ⅱ級），7 d明顯增多（Golijeh評分Ⅲ～Ⅴ級），14 d時最明顯。

2.2.3 各實驗組14 d時苔蘚纖維變化觀察 如圖6，點燃組14 d，Timm顆粒在齒狀回，呈連續分布，而非點燃組大鼠（空白組和電極植入組）齒狀回Timm 染色顆粒，呈零星分布，或無分布。

2.2.4 14 d時各組MFS半定量分析 比較各組Golijeh評分，見表3。結果提示電刺激組苔蘚纖維出芽Golijeh評分Ⅱ～Ⅳ級，較點燃組Ⅳ～Ⅴ級低。

3 討論

本實驗采用單側局部注射KA于大鼠HP腹后側后部的方法造成局限性癲癇灶，行為上與人類顳葉癲癇的臨床病程特點相似[5]。苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MFS）是顳葉癲癇中標志性的軸突出芽，突出的病理表現。這些異常突觸的形成，促進了海馬興奮性環路的建立，同時對癇性放電的產生及擴散起到了易化作用。動物癲癇模型研究提示，苔蘚纖維出芽與癲癇的自發發作關系密切，容易出現自發癲癇的動物，其海馬苔蘚纖維出芽出現早，且MFS較多。沒有自發癲癇或癥狀輕的動物，海馬組織發現MFS并不明顯[6-7]。同時在人類顳葉癲癇組織病理檢查中，也發現MFS與癲癇形成有關[8-9]。本實驗觀察到不同時間段海人酸模型，海馬苔蘚纖維出芽的病理變化過程，在點燃4 d時，內分子層可見有Timm顆粒的沉積，在7 d已較明顯，14 d時尤為顯著，結合慢性期行為學和腦電的變化，說明KA模型中MFS與KA誘發的自發性癲癇發作密切相關。

實驗證明，海馬在顳葉癲癇的啟動和傳播扮演很重要的角色，同時在海馬最先可檢測癇樣放電[10-11]。在癲癇模型動物研究中，Wyckhuys等[12]通過對大鼠海馬高頻電刺激，發現海馬后放電（after discharges，AD）閾值提高，潛伏期變長，時程縮短。表明高頻電刺激海馬有降低異常通路的興奮性，增強潛在的抑制作用，從而減少異常放電。在人類對顳葉癲電刺激治療研究中，Cukiert等[13]用海馬深部電刺激治療了9名難治性顳葉癲癇患者。其中單側海馬硬化使用單側DBS并且癲癇發作頻率減少了76%～80%。雙側海馬硬化患者（n=4）接受雙側植入。其中3名患者接受單側刺激，癲癇發作頻率降低66%～100%。本研究中發現，在對KA致癇大鼠進行高頻電刺激，大鼠自發性癲癇發作次數明顯減少，發作級別降低，同時腦電顯示異常放電明顯減少，提示海馬癲癇灶高頻電刺激，對癲癇發作及異常放電有抑制的作用[14]。

腦深部電刺激術（deep brain stimulation，DBS）治療癲癇的作用機制仍不清楚[15]，目前包括電流直接作用于顱內特定結構引起的局部抑制及從刺激部位投射到其他中樞神經結構產生投射抑制效應。根據上述可能的作用機制，有四種假想被提出，包括去極化阻滯、突觸抑制、突觸阻抑、刺激改變了病理性神經網絡功能。本研究結果提示，高頻電刺激海馬癲癇灶在一定程度上抑制海馬苔蘚纖維異常出芽，致癇后14 d，Timm顆粒Golijeh評分電刺激組較點燃組低（P<0.05）。由此考慮，高頻電刺激控制癲癇發作的作用機制之一是通過抑制海馬苔蘚纖維出芽，防止異常興奮環路的建立，降低癇樣放電和癲癇發作敏感性。電刺激通過何種方式抑制海馬苔蘚纖維異常出芽有待進一步研究。

參考文獻

[1]李世綽，洪震.臨床診療指南：癲癇分冊（2015修訂版）[M].北京：人民衛生出版社，2015.

[2] Schmeiser B，Li J，Brandt A，et al.Different mossy fiber sprouting patterns in ILAE hippocampal sclerosis types[J].Epilepsy Res，2017，136：115-122.

[3] Van Den Herrewegen Y，Denewet L，Buckinx A，et al.The Barnes Maze Task Reveals Specific Impairment of Spatial Learning Strategy in the Intrahippocampal Kainic Acid Model for Temporal Lobe Epilepsy[J].Neurochem Res，2018，10（6）：612-619.

[4] Buckmaster P S.Does mossy fiber sprouting give rise to the epileptic state[J].Adv Exp Med Biol，2014，813：161-168.

[5]李欣，羅海龍，楊印東，等.海人酸致癲癇模型大鼠尿樣的代謝組學動態觀察[J].齊齊哈爾醫學院學報，2013，34（23）：3438-3439.

[6] Zhang X，Qu H，Wang Y，et al.Aberrant plasticity in the hippocampus after neonatal seizures[J].Int J Neurosci，2018，128（4）：384-391.

[7]劉菁，李保敏，孫若鵬，等.幼鼠反復癲癇發作致苔蘚纖維發芽的動態變化及其與自發性發作的關系[J].山東大學學報：醫學版，2013，51（11）：16-20，36.

[8] Crèvecoeur J，Kaminski R M，Rogister B，et al.Expression pattern of synaptic vesicle protein 2 （SV2） isoforms in patients with temporal lobe epilepsy and hippocampal sclerosis[J].Neuropathol Appl Neurobiol，2014，40（2）：191-204.

[9] Martinian L，Catarino C B，Thompson P，et al.Calbindin D28K expression in relation to granule cell dispersion，mossy fibre sprouting and memory impairment in hippocampal sclerosis：a surgical and post mortem series[J].Epilepsy Res，2015，98（1）：14-24.

[10] Landazuri P.Mesial temporal lobe epilepsy：a distinct electro clinical subtype of temporal lobe epilepsy[J].Neurodiagn J，2014，54（3）：274-288.

[11] Nakahara S，Adachi M，Ito H，et al.Hippocampal Pathophysiology：Commonality Shared by Temporal Lobe Epilepsy and Psychiatric Disorders[J].Neurosci J，2018，2018：4852359.

[12] Wyckhuys T，De Smedt T，Claeys P，et al.High frequency deep brain stimulation in the hippocampus modifies seizure characteristics in kindled rats[J].Epilepsia，2007，48（8）：1543-1550.

[13] Cukiert A，Cukiert C M，Burattini J A，et al.Seizure outcome after hippocampal deep brain stimulation in a prospective cohort of patients with refractory temporal lobe epilepsy[J].Seizure，2014，23：6-9.

[14] Bondallaz P，Bo?x C，Rossetti A O，et al.Electrode location and clinical outcome in hippocampal electrical stimulation fo rmesial temporal lobe epilepsy[J].Seizure，2013，22（5）：390-395.

[15] Klinger N，Mittal S.Deep brain stimulation for seizure control in drug-resistant epilepsy[J].Neuro Surg Focus，2018，45（2）：E4.