“葉綠體色素的提取和分離”實驗縮時改進的探討

應學超（上海市金山中學 上海 201599）

葉綠體色素的構成、比例和含量水平，直接反映了光合植物的光合作用水平、環境響應方式等。葉綠體色素的質、量，在分析與葉綠體色素變化相關的生理機制［1］，探討光系統中能量轉移等規律，以及研究環境因素對植物生長發育的影響［2-3］等工作中都很重要。在“葉綠體色素的提取和分離” 實驗教學過程中，經常遇到一些問題，致使無法如期完成教學內容、達成教學目標，實驗效果也不甚理想。因此，筆者利用研磨過濾器（北京川布蘭生物技術開發有限公司）對本實驗進行了一定的改進。

1 實驗教學過程中存在的問題

1.1 操作步驟多，完成實驗時間長 在常規“葉綠體中色素的提取和分離”實驗中，學生根據教材中的實驗步驟進行操作。由于實驗步驟多，學生實驗操作時間一般需要20～25 min；即使提前充分預習，最快至少需要15 min 以上才能完成。因此根據教材常規情況下教學，時間比較緊張，留給學生進行實驗現象觀察、分析和拓展延伸的時間并不多。

1.2 操作要求高，實驗效果不穩定 常規實驗對整個實驗操作要求比較高，任何操作步驟有問題，都容易導致實驗效果不穩定。例如，研磨操作要求迅速充分研磨，但很多情況下學生不擅長使用研缽，導致研磨速度慢，研磨不充分，色素提取含量低；過濾操作時，學生不易把握脫脂棉的用量，或碳酸鈣、石英砂的加入量過大，導致過濾速度慢、濾液含量少和濾液雜質多等問題；畫濾液細線時，用毛細吸管會使得濾液出現印染現象，導致色素分離不明顯；層析操作要求根據試管底部層析液的量，調整濾紙長度并掛到試管軟木塞的鉤子上，學生很難估計準確，導致濾液細線浸入層析液或接觸不到層析液的情況，需要較多時間進行調整。

2 相關研究進展

目前已有的研究中對于“葉綠體色素的提取和分離”實驗的改進，主要集中在以提升實驗效果為主要目的的步驟改良。例如，左小龍等［4］提出可使用薄層層析等方法替換原有步驟，并進一步分離、收集4 種色素，測定吸收光譜，強化學生的理解；楊建勝等［5］提出可增加乙酸乙酯溶解胡蘿卜素和色素萃取步驟，提高實驗成功率；陳琳［6］提出石油醚+丙酮（20∶2）層析效果較好；周臻華［7］提出選取龍葵或烏蘞莓提取的色素效果較好；朱靜［8］提出“推血涂片方法”畫濾液細線會“直、細、均、齊”等。根據這些改進，實驗效果確有提高，但是實驗的操作時間并沒有縮短，甚至用時更長，對實際教學的幫助并不大。

3 實驗改進措施

3.1 實驗材料的選擇 教材建議使用新鮮的菠菜或青菜作為實驗材料。菠菜或青菜的主葉脈明顯，準備材料時需要學生去除大量葉脈，花費時間較多。韭菜為平行葉脈，無明顯主葉脈，本實驗將實驗材料替換為韭菜，避免了去除葉脈的步驟，節約了時間，且韭菜提取到的葉綠體色素最終層析結果與菠菜、青菜沒有明顯差異。

3.2 實驗材料的處理 教材中需要對實驗材料進行去主葉脈、剪碎、稱量，但該實驗是定性實驗，準確稱量意義不大。因此將此步驟改為“用剪刀切取稍經風干脫水處理的韭菜葉，剪碎，加入研磨過濾器中至約1／3 容量（圖1）”。教師預估實驗中的韭菜葉用量，學生根據估算方式進行操作與最理想狀態并無明顯差異，縮短操作用時至約1 min。

圖1 實驗材料的處理

3.3 研磨過濾步驟合并 教材中研磨過濾分為2步，操作較多，耗時較長，容易出現操作問題。因此，在本實驗中改為“在研磨過濾器中加入少量石英砂和碳酸鈣，一次性加入3 mL 無水乙醇，進行迅速、充分的研磨后，用移液器吸取濾液，并收集到一個小指管中（圖2）”。研磨過濾器集成了研磨和過濾2 種功能，可在極短時間內（約2 min）就完成研磨與過濾步驟，研磨更為便捷、快速、充分，且在研磨同時完成過濾，省時高效、效果較好［9］。改進后實驗藥品的用量進一步減少。為了避免研磨時乙醇揮發導致的損失，原本需要分次加入總量5 mL 的無水乙醇進行提取，現在只需要3 mL 即可保證提取樣品的效果，同時石英砂與碳酸鈣的用量也明顯減少。

圖2 研磨過濾

3.4 濾液的處理 教材中過濾后的濾液未做任何處理，故常出現渾濁狀態。因此，在此增加步驟“將小指管放于迷你離心機中，5 000 rpm，離心15 s，靜置備用（圖3）”。離心后的濾液更澄清，觀察效果更好，減少了雜質存在對劃濾液細線步驟的影響，本步驟操作需要約1 min。

圖3 濾液的離心

3.5 濾紙條的制備 將教材中的濾紙條尺寸由18 cm×2 cm 改為8 cm×1 cm，濾紙條的一端剪角標記操作不變。本步驟的改變主要為適應展層瓶的容積，操作需要約1 min。

3.6 畫濾液細線 教材中所用的毛細吸管畫濾液細線的方式極容易出現印染現象。因此，將毛細吸管替換為加樣板（圖4）能很好的控制加樣量，最大程度避免出現印染現象，并且能保證在較短時間內將濾液細線畫的又細又直，也保證了最終的實驗效果相對更好更清晰，實驗成功率更高。本步驟操作需要約3 min。

圖4 畫濾液細線

3.7 色素的層析 教材中用塞子上加小鉤的大試管進行層析，需要根據試管底部層析液的量調整濾紙長度。因此，本實驗改為“將2 mL 層析液置于展層瓶中，將加好樣的濾紙條點端向下放入展層瓶中，蓋好瓶蓋進行分離（圖5）”。改進后的操作避免了學生根據試管層析液調整濾紙的長度，進一步縮短操作時間至約2 min。

圖5 色素的層析

4 總結

實驗改進后，在保證整體成功率的前提下，操作時間大幅度縮短，由原本的20～25 min 縮短至約10 min，并且實驗的材料用量減少約一半，避免了實驗材料的浪費。確保實驗后學生有充分的時間進行實驗結果的觀察、分析和拓展，有效提高了實驗教學的效果。