下調NDRG4表達對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

劉巍，賈朝陽，潘文婧，白曉絮，馮書君，譚文華

(哈爾濱醫科大學第二附屬醫院，哈爾濱150001)

卵巢癌病死率在女性惡性腫瘤中排第5位。最新數據顯示，全球每年新增卵巢癌確診病例225 500例，病死率高達62%。盡管激素替代療法的改變使得卵巢癌發病率有所下降，但該病診斷及治療研究并未取得顯著進展。N-myc下游調節基因家族(NDRGs)有4個成員，即NDRG1、NDRG2、NDRG3、NDRG4。這些家族成員在正常的腦組織、心臟組織、骨骼肌組織中呈高表達[1]。NDRG4作為癌癥相關基因，被認為參與了癌癥的發生發展，但是在各種癌癥中發揮的作用可能不同。在結腸癌中NDRG4被認為扮演抑癌基因角色，可抑制結腸癌細胞的增殖和轉移[2]；而在惡性腦膜瘤中NDRG4則具有促進腫瘤細胞遷移和侵襲的作用[3]。本課題組前期研究表明，NDRG4在卵巢癌組織中低表達[4]，但關于NDRG4基因在卵巢癌發生發展中的具體作用目前報道較少。SKOV3是一種順鉑耐藥的人卵巢癌腺癌細胞系，HO8910是一種高轉移性人卵巢癌腺癌細胞系，兩種細胞系是卵巢癌基礎研究中最常用的細胞模型。2017年6月～2018年10月，我們觀察了下調NDRG4表達后SKOV3、HO8910細胞增殖和凋亡的變化，初步探討NDRG4在卵巢癌發生和發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要實驗材料 SKOV3、HO8910細胞由黑龍江轉化醫學中心饋贈，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基、5% CO2、37 ℃的細胞孵箱內常規培養，當細胞融合度達80%時進行傳代。RPMI1640培養基購于Hyclone公司,胎牛血清購于杭州四季青公司。細胞消化胰酶、BCA試劑盒購自碧云天公司,Opti-MEM培養基、Lipo2000購自Invitrogen公司。NDRG4、Bcl-2、Bax、P38/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p-P38/MAPK一抗購自Abcam公司,β-actin抗體購于CST公司。

1.2 細胞分組、轉染及NDRG4檢測 將SKOV3細胞、HO8910細胞各分為轉染組和對照組。兩組均于細胞融合度達60%時進行轉染。轉染組細胞轉染siRNA-NDRG4，序列為5′-CAAACTATGCTTCAACACCTT-3′；對照組細胞轉染無意義空白siRNA(siNc)，序列為5′-CGACGTAAACGGCCACAAGTT-3′。按試劑說明要求，將siRNA、Opti-MEM及Lipo2000混合物加入不含血清的RPMI1640培養基中，6 h后更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養基。轉染72 h后，采用Western blotting法檢測細胞中的NDRG4蛋白：加入RIPA蛋白裂解液，常規提取細胞蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度；蛋白樣品經過SDS-PAGE凝膠電泳后，轉至PVDF膜上，羊奶粉封閉；4 ℃下加一抗NDRG4(1∶800)、β-actin(1∶1 000)孵育過夜；PBST漂洗PVDF膜后，置于室溫下加二抗孵育1 h，再次用PBST漂洗；化學發光法檢測目的蛋白表達強度。結果顯示，轉染組SKOV3、HO8910細胞中NDRG4蛋白表達水平(分別為0.243±0.022、0.182±0.019)顯著低于對照組(分別為0.523±0.031、0.423±0.072)。見圖1。證明所用siRNA-NDRG4序列有效，可以用于后續實驗。

圖1 轉染組和對照組SKOV3、HO8910細胞中NDRG4表達情況(Western blotting法)

1.3 細胞增殖能力觀察 分別于轉染后0、24、48、72 h檢測細胞增殖能力。將轉染組和對照組SKOV3、HO8910細胞以1×103/孔接種于96孔板中，在某固定時間處理同一培養板，在每孔中加入20 μL的MTT，37 ℃細胞培養箱中孵育4 h后每孔加入150 μL的二甲基亞砜，用酶聯免疫儀于490 mm波長處測吸光度值表示細胞增殖能力，制作細胞增殖曲線。所有實驗重復3次。

1.4 細胞凋亡情況觀察 將轉染組和對照組SKOV3、HO8910細胞接種于6孔板，常規轉染48 h后用胰酶消化細胞，離心并收集沉淀，加入5 μL的AnnexinV-FITC和5 μL的碘化丙啶避光孵育15 min，采用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況并計算細胞凋亡率。所有實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡相關蛋白及P38/MAPK通路相關蛋白檢測 在兩組細胞中加入RIPA蛋白裂解液，常規提取細胞蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經過SDS-PAGE凝膠電泳后，轉至PVDF膜上，羊奶粉封閉；4 ℃下加一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、p-P38/MAPK(1∶800)、P38/MAPK(1∶800)、β-actin(1∶1 000)孵育過夜；PBST漂洗PVDF膜后，置于室溫下加二抗(1∶10 000)孵育1 h，再次用PBST漂洗；化學發光法檢測目的蛋白(Bcl-2、Bax、p-P38/MAPK、P38/MAPK)表達強度。所有實驗重復3次。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 轉染組和對照組SKOV3、HO8910細胞轉染后24 h細胞增殖能力差異無統計學意義。轉染組SKOV3細胞轉染后48、72 h增殖能力(分別為1.226±0.121、1.483±0.050)高于對照組(分別為0.880±0.061、1.103±0.070)，P分別為0.011、0.001；轉染組HO8910細胞轉染后48、72 h增殖能力(分別為1.020±0.107、1.303±0.241)高于對照組(分別為0.800±0.070、0.980±0.060)，P分別為0.034、0.002。

2.2 兩組細胞凋亡率比較 轉染組SKOV3細胞早期凋亡率為23.20%±4.41%、晚期凋亡率為8.40%±2.21%，均低于對照組的28.72%±3.21%、14.12%±3.81%(P分別為0.032、0.021)；轉染組HO8910細胞早期凋亡率為24.10%±5.82%，晚期凋亡率為9.40%±3.12%，均低于對照組的30.22%±6.12%、15.21%±4.92%(P分別為0.012、0.045)。

2.3 兩組細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達比較 轉染組、對照組SKOV3細胞中Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.624±0.212、0.212±0.049，Bax蛋白相對表達量分別為0.341±0.105、0.751±0.172；轉染組、對照組HO8910細胞中Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.275±0.041、0.143±0.009，Bax蛋白相對表達量分別為0.314±0.021、0.599±0.064。轉染組SKOV3、HO8910細胞中Bcl-2蛋白相對表達量較對照組增高，Bax蛋白相對表達量較對照組降低(P均<0.05)。見圖2。

圖2 兩組SKOV3、HO8910細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達情況(Western blotting法)

2.4 兩組細胞中P38/MAPK通路相關蛋白表達比較 轉染組、對照組SKOV3細胞中p-P38/MAPK相對表達量分別為0.149±0.014；0.227±0.073；P38/MAPK相對表達量分別為0.545±0.081、0.604±0.068；轉染組、對照組HO8910細胞中p-P38/MAPK相對表達量分別為0.281±0.004、0.682±0.051，P38/MAPK相對表達量分別為0.615±0.034、0.657±0.054。轉染組SKOV3、HO8910細胞中p-P38/MAPK相對表達量低于相應對照組(P均<0.05)。見圖3。

3 討論

NDRG4位于人染色體16q21，在各種癌癥的發生進展中發揮不同作用[5，6]。在結直腸癌中NDRG4被證明是一個抑癌基因，可以影響PI3K/AKT信號通路的活性；因此，糞便標本NDRG4檢測有望成為診斷早期結直腸癌的方法[7]。在腦膠質瘤中，NDRG4表達明顯下降，并與患者的預后相關[8]。在胃癌中，NDRG4啟動子甲基化水平與患者預后相關[9]。

圖3 兩組SKOV3、HO8910細胞中P38/MAPK、p-P38/MAPK表達情況(Western blotting法)

由于卵巢在盆腔的位置較深，絕大部分卵巢癌患者就診時已處于中晚期，伴隨有廣泛的盆腔、腹腔轉移，患者5年生存率不足30%，尋找有效的卵巢癌治療新靶點勢在必行[10]。NDRG4在多種癌癥中被認為與腫瘤細胞增殖能力相關[11，12]。本課題組前期研究發現，對比正常卵巢組織，卵巢癌組織中NDRG4的表達顯著降低，并且與卵巢癌的分化程度和病理分期相關[4]。本研究觀察了NDRG4對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其相關的分子生物學機制。我們應用siRNA下調了人卵巢癌細胞SKOV3、HO8910中NDRG4的表達水平，發現下調了NDRG4表達的卵巢癌細胞增殖能力明顯上升，提示在卵巢癌中NDRG4具有抑制細胞增殖的作用。

細胞凋亡與癌癥的發生發展密切相關，這一生物學過程受到多種基因的影響。Bcl-2家族是研究最多的一類凋亡相關蛋白，包含了Bcl-2、Bax等。大量研究表明，Bcl-2家族可以通過多種途徑影響細胞凋亡，包括與線粒體的相互作用、與凋亡家族其他蛋白的相互作用等[13,14]。本研究結果顯示，抑制NDRG4表達后，卵巢癌細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率明顯下降，Bcl-2表達水平增高而Bax表達水平下降，表明在卵巢癌中NDRG4可以誘導細胞凋亡。細胞凋亡分為內源性凋亡和外源性凋亡。外源性細胞凋亡包括對下游Fas、DR4、DR5等蛋白的調控，而內源性細胞凋亡則可導致包括線粒體膜結構不穩定、細胞色素C釋放、Caspase相關蛋白和Bcl-2家族蛋白表達水平的改變[15,16]。在內源性細胞凋亡途徑中，位于線粒體膜外的Bax蛋白轉移，可加強細胞色素C的外流，進而誘發內源性凋亡的瀑布式啟動[17]。本研究結果提示NDRG4所誘發的卵巢癌細胞凋亡有部分是通過Bcl-2家族蛋白調節的內源性細胞凋亡來實現的。NDRG家族誘導細胞凋亡在多種惡性腫瘤相關研究中被報道過。Liu等[18]研究顯示，下調NDRG2表達后可抑制p53介導的細胞凋亡。在星形膠質細胞瘤中下調p53的表達可導致NDRG2表達下調，NDRG2可作為p53誘導凋亡的一個相關調節基因[19]。

MAPK是一組重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種癌癥的調節過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應等。MAPK細胞信號通路可以分為細胞外調節蛋白激酶(ERK)通路、P38通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路及細胞外信號調節激酶5(ERK5)通路。在卵巢癌相關研究中涉及最多的是P38/MAPK通路，該通路被認為廣泛參與卵巢癌發生發展過程。WAVE3作為癌基因，可通過作用于P38/MAPK細胞信號通路促進卵巢癌細胞增殖[20]。Feng等[21]研究表明，Wip1對卵巢癌細胞凋亡的影響與調節P38/MAPK信號通路活性有關。本研究結果顯示，轉染組SKOV3、HO8910細胞中p-P38/MAPK相對表達量低于相應對照組，提示NDRG4對卵巢癌細胞增殖和凋亡的作用可能是通過調節P38/MAPK信號通路活性實現的。

綜上所述，NDRG4表達下調后卵巢癌細胞增殖能力增高、凋亡減少，其機制可能與調節Bcl-2/Bax表達及P38/MAPK信號通路活性有關，更加詳細的分子生物學機制有待于進一步探討。