番石榴葉總黃酮對AngⅡ誘導的乳鼠心肌細胞肥大的抑制作用及機制

劉敏敏，周迎春

(1天津市寶坻區人民醫院，天津301800；2南方醫科大學)

早期心肌細胞肥大是心臟負荷增加時的主要代償機制之一，隨著心臟負荷增加，可發展至心衰。阻斷胞外信號通路介導的心肌細胞肥大效應，對防治心力衰竭和心臟事件具有重要意義[1，2]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是體內重要的內分泌因素，不僅調節著心血管系統的生理功能，在心肌肥厚和心力衰竭過程中也發揮重要作用[3，4]。AngⅡ對心肌細胞的作用主要是通過血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)介導的，AT1R活化后可激活細胞膜的磷脂酶系統，生成三磷酸肌醇和二酰基甘油，后兩者使胞內Ca2+濃度升高及蛋白激酶C(PKC)活化。活化的PKC可轉位入核，調節核內的基因表達，促進心肌細胞肥大[5]。AT1R-PKC作為介導心肌細胞肥大的經典通路，備受關注。藥理研究顯示，黃酮類化合物具有抗心腦血管病、抗氧化、鎮痛、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節等作用，臨床可用于治療冠心病、心律失常、高血壓、腦栓塞、肝炎、肝硬化、肝癌等多種疾病[6]。已有研究證實，榅桲總黃酮、水杉總黃酮、蕎麥花總黃酮具有抗大鼠心肌肥厚的作用[7～9]。中藥番石榴葉中含有β-谷甾醇、槲皮素、番石榴苷、無色矢車菊素、番石榴酸等成分，黃酮類化合物為其主要成分,目前關于番石榴葉總黃酮對抗心肌肥大的作用尚未見報道。2015年1～10月，我們采用AngⅡ誘導乳鼠心肌細胞肥大，觀察番石榴葉總黃酮對心肌細胞肥大的抑制作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級Wistar乳鼠，出生1～3 d，購自南方醫科大學實驗動物中心。番石榴葉總黃酮(純度55.22%)由本課題組前期提取并保存，使用時加入DMSO溶解，用DMEM稀釋。AngⅡ購自Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青，DMEM高糖培養基購自Gibco公司，胰蛋白酶購自AMRESCO公司。主要儀器為CO2培養箱、L420臺式低速自動平衡離心機、倒置相差顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞的分離與培養 取乳鼠心臟，清洗后剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。加入胰蛋白酶消化，棄上清液，獲得心肌細胞。加入0.01%胰蛋白酶吹打混勻，制成細胞懸液，調整細胞密度為1×106/孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養24 h。更換含10% FBS的DMEM高糖培養基繼續培養24～48 h，每24 h換液1次。加入含0.1% FBS的DMEM進行無血清培養48 h。

1.2.2 番石榴葉總黃酮最佳作用濃度的確定 采用MTT法。將心肌細胞按2×104/孔接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h。更換含1%血清的DMEM培養液，37 ℃繼續孵育24 h，使細胞進入對數生長靜止期。棄上清，加入含15%小牛血清的DMEM培養液和50、100、150、200、250 μg/mL番石榴葉總黃酮培養24 h。于藥物刺激結束前4 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL。吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結晶充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上540 nm波長處測定吸光度(OD)值。結果顯示，在50～200 μg/mL劑量范圍內，細胞增殖能力逐漸增強，以200 μg/mL時最強，250 μg/mL時細胞增殖能力開始下降。150、200、250 μg/mL組間兩兩比較差異無統計學意義(P均>0.05)。故本實驗選取50、100、150 μg/mL作為番石榴葉總黃酮的低、中、高劑量組。

1.2.3 細胞分組與處理 取對數生長期心肌細胞，分為模型組和番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組。模型組加入AngⅡ 0.1 μmol/L培養24 h誘導心肌細胞肥大，番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組先分別加入番石榴葉總黃酮50、100、150 μg/mL預處理24 h，然后加入AngⅡ 0.1 μmol/L培養24 h。另設正常對照組，加入含10% FBS的DMEM培養48 h。

1.2.4 細胞面積測算 采用免疫熒光染色法。收集各組細胞，吸棄培養液，加入4%多聚甲醛固定，PBS洗滌。加入封閉液封閉60 min，Actin抗體溶于1% BSA-PBS中(1∶500)，搖床上緩慢搖動孵育2 h；羊抗小鼠IgG-FITC加入(1∶300)，室溫側擺搖床上緩慢搖動孵育1 h以特異性識別Actin抗體，熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態，應用Image-Pro Plus5.0軟件計算細胞面積。

1.2.5 細胞總蛋白含量檢測 收集各組細胞，加入細胞裂解液制成細胞懸液，計數每孔心肌細胞數。沉淀細胞后加入150 μL NP-40溶劑細胞膜，離心取上清，用Bradford法測定細胞總蛋白含量，以BSA 0.5 mg/mL為標準品作標準曲線，計算各孔總蛋白含量。

1.2.6 細胞中AT1R、PKC蛋白表達檢測 采用Western blotting法。加入細胞裂解液提取心肌細胞中的蛋白，離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，10% SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉90 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，1×TBS液洗滌3次，加入二抗，37 ℃孵育，1×TBS液洗滌3次。ECL化學發光試劑盒顯色，KODAK Image Station 4000MM圖像系統曝光，分析讀取條帶灰度值，計算目標蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞面積比較 正常對照組、模型組和番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組心肌細胞面積分別為(742.06±236.56)、(9 195.23±2 498.76)、(4 473.91±1 081.372)、(2 649.37±300.64)、(2 107.43±106.09)μm2。與正常對照組比較，模型組心肌細胞面積增加(P<0.01)；與模型組比較，番石榴葉總黃酮各劑量組心肌細胞面積縮小，其中高劑量組小于中、低劑量組(P均<0.01)。

2.2 各組細胞總蛋白含量比較 正常對照組、模型組和番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組心肌細胞總蛋白含量分別為(344.31±35.46)、(677.93±36.69)、(598.51±19.38)、(521.30±24.59)、(486.39±32.12)pg/孔。與正常對照組比較，模型組心肌細胞總蛋白含量升高(P<0.05)；與模型組比較，番石榴葉總黃酮各劑量組心肌細胞總蛋白含量減少，其中高劑量組少于中、低劑量組(P均<0.05)。

2.3 各組細胞AT1R、PKC蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，模型組AT1R、PKC蛋白表達升高(P均<0.01)；與模型組相比，番石榴葉總黃酮各劑量組AT1R、PKC蛋白表達降低，其中高劑量組低于中、低劑量組(P均<0.01)。

表1 各組心肌細胞AT1R、PKC蛋白表達水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與番石榴葉總黃酮高劑量組比較，△P<0.01。

3 討論

心肌細胞肥大是以蛋白質合成增多為主要特征的生長異常，是心肌肥厚的主要病理學改變，也是引起心功能異常的重要原因。番石榴葉是我國傳統中藥，是桃金娘科植物番石榴的干燥葉及帶葉嫩莖。其性平、味甘澀，具有收斂止瀉、消炎止血的功效。番石榴葉中含有的黃酮類化合物具有抗心腦血管病、抗氧化、鎮痛、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節等作用。本研究結果顯示，向乳鼠心肌細胞加入AngⅡ后，心肌細胞面積、心肌細胞總蛋白含量顯著升高；而經番石榴葉總黃酮預處理后再加入AngⅡ，心肌細胞面積、心肌細胞總蛋白含量明顯降低。表明番石榴葉總黃酮能夠抑制AngⅡ導致的細胞體積增大、蛋白合成增加。

AngⅡ在心肌細胞肥大的發生發展過程中起重要作用。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(RAAS)中最重要的活性成分，具有直接促進心肌細胞肥大的效應以及生長因子樣作用，可以在不增加血管阻力和心臟后負荷的情況下直接刺激心肌細胞蛋白質合成增加，導致心肌肥厚。AngⅡ對心肌細胞的作用主要通過AT1R介導。AT1R是一種7次跨膜的G蛋白偶聯受體(GPCR)，AT1R的過度激活可導致心肌肥大及纖維化，在心肌重構過程中發揮重要作用。激活的AT1R使心肌細胞G蛋白活化并與磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C發生偶聯，引起心肌細胞膜外Ca2+跨膜內流和胞質內Ca2+貯存池釋放增加，并誘導細胞外信號調節激酶ERK1/2、JNK信號轉導和轉錄激活因子、鈣調節蛋白依賴性激酶Ⅱ和PKC等相關蛋白激酶的激活，繼而誘導c-FOS、c-JUN等即刻早期反應基因的表達以及相關蛋白質合成的增加，最終造成心肌損傷[10，11]。

PKC是肥大信號傳遞中一個限速的分子開關，是肥大信號傳遞的共同通路之一[12～14]。PKC是鈣/磷依賴的蛋白激酶，可催化各種蛋白質底物上的絲氨酸或蘇氨酸殘基使其磷酸化，進而控制細胞增殖；PKC自身也可以進入細胞核，是核蛋白磷酸化的重要激酶[15，16]。PKC存在于心臟組織中的所有細胞內，包括肌細胞、纖維母細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和神經元。正常情況下，PKC幾乎均以無活性的形式存在于細胞質中，當受到外界刺激時，PKC以Ca2+依賴的形式從細胞質中移位到細胞膜上，此過程稱之為轉位。PKC向細胞膜的轉位是其激活的標志[17]。PKC不僅可以轉位到細胞膜上，而且可以直接進入細胞核，在細胞核內調節心肌細胞基因轉錄[18]。AT1R-PKC作為介導心肌細胞肥大的經典通路，備受關注。

本研究結果顯示，向乳鼠心肌細胞加入AngⅡ后，心肌細胞中AT1R、PKC蛋白的表達顯著升高，而經番石榴葉總黃酮預處理后再加入AngⅡ，AT1R、PKC蛋白的表達明顯降低。表明番石榴葉總黃酮能夠抑制由AngⅡ引起的心肌細胞AT1R、PKC表達激活。由此推測，抑制AT1R-PKC通路的表達可能是番石榴葉總黃酮抑制心肌細胞肥大的重要機制之一。

綜上所述，番石榴葉總黃酮預處理能夠抑制AngⅡ導致的心肌細胞肥大，其機制與抑制AT1R-PKC通路激活有關。因此，番石榴葉總黃酮可能成為抗心肌細胞肥大的新藥物,明確其藥理學作用可為臨床治療心肌肥厚及改善左心室重構提供新的治療策略。