醒腦靜注射液對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶能力及海馬區自噬相關蛋白表達的影響

李小亮，李林，陳揚，孫林林，李君，付愛軍

(1華北理工大學，河北唐山063000；2開灤總醫院林西醫院；3華北理工大學附屬醫院；4鄭州市第七人民醫院)

動脈瘤性蛛網膜下腔出血(SAH)是嚴重威脅人類身體健康的急性腦血管疾病，其起病突然，癥狀變化多樣，致死率、致殘率高[1]。近年研究發現，自噬在SAH損傷機制中具有重要作用，一定程度上活化的自噬對SAH大鼠神經功能有積極作用[2]。醒腦靜注射液是由傳統中成藥安宮牛黃丸演化而來并經過現代化工藝提純的中藥注射制劑，具有中樞神經保護作用，臨床用于治療缺血性腦血管、出血性腦血管病及顱腦損傷等疾病。醒腦靜注射液可以通過血腦屏障起到清除氧自由基、減輕炎癥反應的作用，但對SAH后自噬的研究較少。2017年12月～2018年11月，我們通過制作大鼠SAH模型，觀察醒腦靜注射液對大鼠海馬區神經細胞中自噬相關蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表達的影響及其行為學變化，探討醒腦靜注射液腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠36只，2～3月齡，體質量(340±25)g，由華北理工大學曹妃甸學區臨床醫學院實驗動物中心飼養。適應性喂養5 d，室溫(23±2)℃，濕度50%±10%，自然光照，自主進食飲水。

1.1.2 藥品、試劑與儀器 醒腦靜注射液(10 mL/支，云南大理藥業股份有限公司)，Beclin-1和LC3Ⅱ抗體(日本株式會社)，內參Tubulin(日本MBL公司)，免疫組化二抗及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。820-Ⅱ型切片機(德國Leica公司)，攝像顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，震蕩儀、電泳儀、電轉槽、凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、醒腦靜組，每組12只。采用頸動脈穿刺法制作SAH大鼠模型[3]。大鼠麻醉，仰臥并固定四肢及門齒，沿中線剪開皮膚，鈍性分離皮下組織及頸部肌肉。游離頸部血管，結扎切斷頸外動脈近心端的分支，遠心端結扎頸外動脈并剪斷，臨時夾閉頸總動脈。頸外動脈殘端剪口，穿入纖芯，牽連頸外動脈使纖芯沿頸內動脈進入顱內，自剪口處穿入約20 mm覺阻力，再穿入1～2 mm刺破血管，維持15 s退出纖芯。結扎頸外動脈，開放頸總動脈恢復血供，將傷口逐層縫合，正常飼養。假手術組只將纖芯沿血管穿入顱內，但不刺破血管，其他手術步驟與模型組相同。醒腦靜組術后立即給予醒腦靜注射液2 mL腹腔注射，1次/12 h；假手術組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 學習記憶能力觀察 采用穿梭箱實驗。大鼠自術前3 d開始進行穿梭箱訓練，3次/d，以培養大鼠的條件反射。于腹腔注射藥物后24 h行穿梭箱實驗[4]，熟悉環境5 min，聲光刺激5 s，接著電擊20 s(1.5 mA)，完成一次實驗。每次間隔20 s，共30次。記錄大鼠的逃避反應時間和逃避反應次數。

1.2.3 海馬神經細胞形態學觀察 采用HE染色法。穿梭箱實驗完成后，每組取6只大鼠麻醉、處死，灌注后冰上取腦。腦組織固定3 d，常規石蠟包埋，切片機以5 μm厚度冠狀切取帶海馬CA1區的切片，一個蠟塊取3張進行HE染色。顯微鏡下觀察海馬CA1區神經細胞形態。

1.2.4 海馬神經細胞Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達檢測 采用免疫組化法。取大鼠海馬組織蠟塊，5 μm厚度冠狀切取帶海馬CA1區切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，加入3% H2O2孵育5 min，枸櫞酸鹽高壓熱修復120 s，PBS緩沖液洗3次。取3張切片滴加Beclin-1抗體(1∶100)，另取3張滴加LC3Ⅱ抗體(1∶100)，4 ℃過夜。滴加二抗，恒溫箱37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液洗3次。DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下觀察神經細胞，隨機選取3個視野采集圖片，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件計數陽性神經細胞數量。

1.2.5 海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白檢測 采用Western blotting法。穿梭箱實驗完成后，每組取6只大鼠麻醉、處死，低溫下取出海馬，勻漿，加入RIPA裂解液，提取組織蛋白，BAC法測定蛋白濃度。電泳、轉膜、抗原封閉，滴加Beclin-1一抗(1∶1 000)、LC3Ⅱ一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，滴加二抗，再次洗膜后化學發光顯影。以β-actin為內參，采用Quantity One軟件對結果進行分析，計算Beclin-1、LC3Ⅱ的相對灰度值。

2 結果

2.1 三組學習記憶能力比較 與假手術組比較，模型組逃避反應時間延長、逃避反應次數減少(P均<0.05)；與模型組比較，醒腦靜組逃避反應時間縮短、逃避反應次數增加(P均<0.05)。見表1。

表1 三組逃避反應時間和次數比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 三組海馬神經細胞形態學比較 假手術組海馬神經細胞多數形態正常；模型組胞核梭形固縮、深染情況明顯增多，并有核破碎現象；醒腦靜組與模型組比較，胞核梭形固縮、深染、核破碎情況明顯減少。

2.3 三組海馬神經細胞Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達情況比較 與假手術組比較，模型組Beclin-1、LC3Ⅱ陽性神經細胞數均增加；與模型組比較，醒腦靜組Beclin-1、LC3Ⅱ陽性神經細胞數均增加(P均<0.05)。見表2。

表2 三組海馬神經細胞Beclin-1、LC3Ⅱ陽性表達數比較(個

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 三組海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達升高(P均<0.05)；與模型組比較，醒腦靜組海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達升高(P均<0.05)。見表3。

表3 三組海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

醒腦靜注射液是由麝香、梔子、郁金、冰片等中藥經過現代化工藝提純而成。麝香氣味芳香，具有通經絡、開竅醒神的功效，可增強神經細胞對氧供不足的適應力，刺激神經細胞，加快意識清醒；梔子清熱解毒、芳香開竅、止痛，能夠增強腦組織對缺氧的耐受力；郁金味苦性寒，具有祛痰開郁通竅的功效；冰片辛香走竄，可通諸竅，增強麝香對神經細胞的興奮作用[5]。諸藥合用，共同發揮清熱瀉火、涼血解毒、開竅醒腦之功效，臨床廣泛用于治療顱腦創傷、腦梗死、高血壓腦出血、蛛網膜下腔出血等多種神經系統疾病[6～10]。現代藥理學研究認為，醒腦靜注射液的神經保護作用機制包括：①降低血清可溶性血管細胞黏附分子1(sVCAM-1)、TNF-α、IL-18等細胞因子的表達水平，從而有效保護中樞神經細胞；②抑制炎癥反應，降低超敏C反應蛋白表達，起到一定的神經保護作用；③通過調節Keap1-Nrf2/ARE氧化應激通路，增強細胞對氧化損傷的耐受程度，進而保護神經細胞，維持正常的神經功能；④降低組織細胞丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，從而拮抗氧自由基，保護神經細胞[11～14]。HE染色可見，模型組海馬神經細胞死亡數量較多，醒腦靜組海馬死亡神經細胞數量較模型組減少。這表明SAH可以損傷海馬神經細胞，導致其死亡;醒腦靜注射液可以減輕SAH對海馬神經細胞的損傷，穩定神經細胞的結構和功能。穿梭箱實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組逃避反應時間延長，逃避反應次數減少；與模型組比較，醒腦靜組逃避反應時間縮短，逃避反應次數增加。這表明SAH大鼠學習記憶能力下降，醒腦靜注射液可以改善SAH大鼠的學習記憶能力，發揮保護神經功能的作用。

自噬是保持細胞自身內環境穩定的一種細胞內溶酶體蛋白降解途徑[15]。通過自噬能夠降解損傷的細胞器和有害物質，并可以為蛋白質的合成和細胞器的更新供給相應的原料，從而維持細胞功能[16]。有學者指出，腦細胞受到有害刺激后存在自噬的發生，并且通過實驗發現適度增強的自噬能夠降低腦細胞死亡率，對腦功能起保護作用[17，18]。研究顯示，SAH后腦細胞發生的自噬在24 h達高峰[19]。本研究結果顯示，SAH造模后24 h時，模型組海馬組織中Beclin-1、LC3Ⅱ陽性神經細胞數目及Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達較假手術組升高，而醒腦靜組高于模型組，表明醒腦靜可以增強SAH大鼠神經細胞自噬。

綜上所述，醒腦靜注射液可以改善SAH大鼠的神經功能，提高其學習記憶能力，該機制可能與增強SAH大鼠海馬區神經細胞自噬有關。本研究可為醒腦靜注射液用于SAH患者的臨床治療提供基礎理論支持。