N-乙酰半胱氨酸對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響及其與自噬的關系

蔡江紅，楊國輝

(貴州醫科大學，貴陽550004)

膿毒癥是重癥監護室常見的急危重癥，病死率極高。膿毒癥是一種全身炎癥反應綜合征，機體對感染反應失調，導致膿毒性休克和多器官功能衰竭。急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥最常見的并發癥，約占膿毒癥患者的70%[1]。當機體受到饑餓、營養缺乏、微生物入侵等應激刺激時，可發生適應性細胞自噬現象，去除壞死物質和受損細胞器，維持細胞存活，保護機體；但過度自噬也可導致細胞死亡[2，3]。膿毒癥引起的炎癥反應及缺血、缺氧、氧化應激產生的活性氧簇(ROS)均使肺細胞啟動自噬維護內環境的穩態，而持續超負荷的刺激將進一步誘導細胞更高水平的自噬，導致細胞功能紊亂，甚至引發炎癥的瀑布性放大作用，導致機體出現肺損傷甚至是多器官功能障礙綜合征(MODS)[4，5]。關于抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療膿毒癥的效果，文獻報道結果并不一致。Hein等[6]報道，膿毒癥患者給予NAC治療后，肝臟血液灌注量明顯增加，乳酸下降，肝功能改善，可能與NAC改善了肝臟的微循環有關。但Spapen等[7]報道，在相同的基礎治療基礎上，NAC治療組與安慰劑治療組的微量蛋白尿/肌酐值(MACR)、序貫器官衰竭評估(SOFA)評分比較差異無統計學意義，NAC治療組心血管SOFA評分甚至有所增加。NAC具有抗氧化、清除自由基、抑制炎癥反應和調控細胞凋亡、調節細胞代謝的作用，但關于其與自噬關系的報道較少。2017年5月～2018年10月，我們通過制作膿毒癥大鼠模型，觀察NAC對膿毒癥急性肺損傷引起的肺組織炎癥和自噬的影響，探討NAC治療膿毒癥的作用機制，為膿毒癥的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠24只，體質量(200±30)g，購自貴州醫科大學實驗動物中心。適應環境飼養1周,溫度20～29 ℃，濕度40%～70%，自然光照，普通飼料喂養，自由攝食飲水。

1.1.2 藥品、試劑與儀器 NAC(德國Sigma公司)，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美國MCE公司)，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(中國欣博盛公司)，Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)兔源多克隆抗體(英國Abcam公司)，鼠源β-actin單克隆抗體、Western blotting辣根過氧化物酶檢測試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、ECL高靈敏度化學發光檢測試劑盒(康為世紀公司)。主要儀器為電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)、光學顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)、多功能酶標儀(美國Bio Tek Instruments)、DYY-64蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、NAC組、3-MA干預組，每組各6只。采用盲腸結扎穿孔(CLP)法制作膿毒癥模型:10%水合氯醛30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，取腹部正中切口，以盲腸盲端1/3處作為結扎點結扎，結扎時保留血管;使用20號針頭將盲腸貫通穿孔，輕輕擠出少許糞便后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。假手術組僅取出盲腸，不結扎、穿孔，體外放置6 min后還納腹腔。

1.2.2 藥物干預與標本采集 術后各組均皮下注射生理鹽水30 mL/kg。基于NAC半衰期為2.5 h，因此NAC組于術后1、4、8、12、16、20 h分別皮下注射NAC 20 mg/kg。假手術組、模型組于相同時間點皮下注射等量生理鹽水。3-MA干預組先于術后1 h腹腔注射3-MA 10 mg/kg，再于術后1、4、8、12、16、20 h分別皮下注射等量生理鹽水。于術后24 h麻醉處死大鼠，開胸，分離兩側肺臟，生理鹽水清洗。取左上肺測定肺組織濕/干重比(W/D)，取右下肺行組織病理學檢查，剩余肺組織置于-80 ℃儲存，用于ELISA、Western blotting和熒光定量PCR檢測。

1.2.3 肺組織W/D測定 取左肺上葉，用濾紙拭干表面水分，稱取質量即肺濕質量(W)；然后置于75 ℃恒溫烤箱中烘烤48 h，稱取質量即肺干質量(D)。計算二者比值即W/D，用于了解肺水腫程度。

1.2.4 肺組織病理學檢查 取右下肺組織，加入4%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm厚薄片。行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化，按照文獻[6]方法進行肺組織病理學損傷評分。評價指標包括組織水腫、滲出、充血、出血、壞死、嗜中性粒細胞浸潤和肺不張，根據嚴重程度分別計0～4分(0分最輕，4分最重)，各項評分相加的總和作為肺組織病理學損傷評分。

1.2.5 肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6檢測 采用ELISA法。取肺組織，制成肺組織勻漿，離心取上清液，按說明書進行加樣、加抗體、洗板、加酶、洗板、顯色、終止反應后，用酶標儀以空白孔調零，在450 nm波長下讀取各孔光密度(OD)值。以標準物濃度為橫坐標、OD值為縱坐標繪制標準曲線，計算TNF-α、IL-6濃度。

1.2.6 肺組織自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1檢測 采用Western blotting法。取肺組織剪碎勻漿，加入蛋白裂解液，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白上樣后，在電泳槽中進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上。加入5%脫脂奶室溫封閉30 min，TBST洗膜5次。分別加入LC3Ⅱ(1∶1 000)、Beclin-1(1∶2 000)及β-actin(1∶5 000)一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入相應的IgG二抗(1∶200)，室溫孵育2 h。ECL化學發光顯色，凝膠成像分析系統檢測各組相應條帶，應用Image J軟件測出目的條帶的灰度值，以目的條帶與內參β-actin條帶的灰度值之比計算目的蛋白的相對表達量。

1.2.7 肺組織自噬相關基因LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。取肺組織，加入TRIzol液提取肺組織總RNA，測定濃度及純度，逆轉錄為cDNA，然后進行實時熒光定量PCR。引物序列：LC3Ⅱ上游引物5′-CCGTCCTGGACAAGACCAAGTTCCTT-3′，下游引物5′-ACACTCACCATGCTGTGCCCATTCA-3′；Beclin-1上游引物5′-GTCTAAGGCGTCCAGCAGCACCAT-3′，下游引物5′-GGTCACTCGGTCCAGGATCTTGAAGC-3′；β-actin上游引物5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，下游引物5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。PCR反應體系(20 μL)：SYBR Primix Ex TaqⅡ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模2.0 μL，dH2O 6.4 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45個循環。反應結束后讀取各樣本的Ct值，應用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 四組肺組織W/D比較 假手術組、模型組、NAC組、3-MA干預組肺組織W/D分別為4.414±0.326、11.175±0.783、6.228±0.452、6.243±0.363。與假手術組比較，模型組W/D升高；與模型組比較，NAC組W/D降低(P均<0.05)；3-MA干預組與NAC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 四組肺組織病理改變 假手術組肺泡結構正常，肺泡腔大小均一，Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞形態正常，胞核清晰，胞質染色均勻，肺泡內無明顯炎性細胞浸潤；與假手術組比較，模型組肺泡增大，體積大小不一，肺泡上皮細胞空泡變性，胞質染色不均，胞內含有大小不等的空泡，相鄰肺泡融合，肺泡間質明顯增寬，間質內有大量中性粒細胞、淋巴細胞及少量巨噬細胞浸潤；與模型組比較，NAC組和3-MA干預組肺泡結構相對完整，大小相對一致，肺間質略有增寬，炎癥細胞浸潤減少。假手術組、模型組、NAC組、3-MA干預組肺組織病理學損傷評分分別為(3.516±0.415)、(10.227±0.617)、(4.952±0.311)、(4.985±0.659)分，與假手術組比較，模型組評分升高；與模型組比較，NAC組和3-MA干預組評分降低(P均<0.05)；3-MA干預組與NAC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 四組肺組織中TNF-α、IL-6表達比較 見表1。

表1 四組肺組織中TNF-α、IL-6水平比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 四組肺組織中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表達比較 見表2。

表2 四組肺組織中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

膿毒癥易誘發多器官功能障礙綜合征，病死率高。急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥最常見的并發癥，病死率為25%～50%[8]。急性肺損傷可由多種原因引起，關鍵因素是炎癥和氧化應激。TNF-α是膿毒癥急性肺損傷炎癥反應的重要促炎因子[9]。TNF-α激活細胞因子后形成級聯反應，誘發IL-1B、IL-6等炎癥介質的合成，形成全身過度炎癥瀑布式反應。自噬是針對體內應激反應而產生的細胞包裹、清除入侵病原及受損細胞器等物質的一種保護性反應，自噬可為細胞提供維持其結構、功能和代謝所需要的物質，從而維持細胞正常的生理功能。研究顯示，自噬具有雙重作用[10]。適度的自噬可保護組織或細胞損傷，而過度的自噬則相反。在脂多糖誘導的急性肺損傷中，自噬水平減弱后，肺損傷程度得到改善[11，12]。據此推測,膿毒癥急性肺損傷發生及發展可能與自噬相關，自噬干預可能作為膿毒癥急性肺損傷的一個治療靶點[13]。

Senoglu等[14]報道，NAC預處理可降低盲腸結扎膿毒癥大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平。Gurer等[15]報道，在燙傷燒傷面積30%后72 h行CLP導致的二次創傷膿毒癥模型中，肺組織病理評分明顯下降。張艱等[16]報道，NAC可通過抑制NF-κB激活而減輕LPS誘導的急性肺損傷的炎癥程度。本研究以肺組織病理學損傷改變、肺組織W/D及肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6水平作為判定肺損傷的主要指標。結果顯示，與假手術組比較，模型組出現了嚴重的肺組織病理損傷改變，肺組織TNF-α、IL-6水平升高，提示CLP法成功制備膿毒癥肺損傷模型。NAC組經NAC治療后，肺組織W/D下降，肺組織病理學損傷改善，TNF-α、IL-6水平下降，說明NAC治療減輕了膿毒癥急性肺損傷的炎癥反應，肺水腫程度好轉，NAC對肺組織具有保護作用。

LC3Ⅱ和Beclin-1均是參與白噬體形成的重要基因，是檢測自噬水平的兩種標志物。LC3是一種泛素樣蛋白，參與吞噬泡的形成，并在吞噬泡的延長和閉合中起重要作用，貫穿自噬體形成的過程[17]。LC3以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在于細胞內，LC3Ⅰ在胞質中呈散在分布，而LC3Ⅱ則較穩定地留在自噬體膜上，因此LC3Ⅱ水平能夠反映自噬體數量。Beclin-1是自噬過程中的重要蛋白，與Vps34形成多蛋白復合體，調節自噬體膜的延伸過程。本研究結果顯示，模型組肺組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表達增強。這說明模型組損傷的肺組織自噬表達增強。提示自噬可能通過促進炎癥反應機制參與并引起了急性肺損傷。NAC組和3-MA干預組LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表達下降，且兩組比較差異無統計學意義。這說明NAC與3-MA能夠下調膿毒癥大鼠肺組織自噬水平，提示NAC可能也是通過調節自噬水平減輕肺組織炎癥反應，改善肺損傷程度。

綜上所述，NAC可能通過抑制膿毒癥肺損傷自噬水平，進而抑制肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6釋放，減輕肺組織的炎癥反應，從而發揮保護肺組織的作用。