結直腸癌組織中MMR蛋白表達缺失的影響因素分析

郭源 張龍 張舜 余彥平 呂勇志 李紀鵬

結直腸癌是一種高度異質性的惡性腫瘤，其發生、發展過程復雜，涉及多個基因的參與[1]。錯配修復（MMR）基因突變導致的MMR缺陷是結直腸癌發生、發展的重要機制[2-3]。研究表明，MMR蛋白表達與腫瘤病理及患者預后相關[4-5]。2017版美國國家綜合癌癥網絡指南建議，對所有結直腸癌患者進行微衛星不穩定（MSI）/MMR檢測[6]。目前研究發現與人類有關的MMR有9種，其中與結直腸癌發生、發展相關的MMR有4種，即MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2[7]。本文對結直腸癌組織中MMR表達情況及影響MMR表達缺失的因素進行分析，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年1月至2017年12月在中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院接受結直腸癌根治術的1 560例結直腸癌患者為研究對象，其中男913 例，女 647 例；年齡 12～92（59.55±13.52）歲。納入標準：（1）臨床病理資料完整；（2）術前未接受過放化療或其他治療；（3）無其他腫瘤。所有患者簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色 使用全自動免疫組化染色儀（BOND-MAX，美國Leica公司）；檢測試劑主要有MLH1單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號ES05、MSH2單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號MX061、MSH6單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號MX056、PMS2單克隆鼠抗人抗體工作液克隆號MOR4G，均購自福州邁新生物技術開發公司。取術中切除的結直腸癌組織樣本，10%甲醛溶液固定，常規連續切片，厚度4μm，脫蠟至水。PBS沖洗，依地酸鈉鈣（EDTA）高壓熱修復2min，室溫下自然冷卻20min，流水沖洗干凈。PBS沖洗5min×3次，置于3%雙氧水浸泡10min，蒸餾水沖洗干凈。PBS沖洗5min×3次，滴加一抗，連孵育盒放入37℃暖箱孵育1h。PBS沖洗5min×3次，滴加二抗，連孵育盒放入37℃暖箱孵育30min。PBS沖洗5min×3次，DAB顯色劑顯色，PBS終止顯色，流水沖洗1min。蘇木素進行復染，鹽酸乙醇用于分化，乙醇及二甲苯分別用于脫水、透明，封片，鏡檢。陽性細胞判斷標準：細胞核呈棕黃色，細胞膜、細胞間質均不著色。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件。計數資料用率表示，影響直腸癌組織中MMR表達缺失的單因素分析采用χ2檢驗或Mann-Whitney U檢驗，多因素分析采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中MMR表達情況 1 560例結直腸癌組織中MMR表達缺失315例（20.2%）。其中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 單獨缺失分別 3、8、17、106例；MLH1 聯合 PMS2、MSH2 聯合 PMS2、MSH2 聯合MSH6、MSH6聯合 PMS2缺失分別 97例、1例、67例、8例；MSH2、MSH6、PMS2 共同缺失 4 例，MLH1、MSH6、PMS2 共同缺失 3 例；MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 共同缺失1例。

2.2 影響結直腸癌組織中MMR表達缺失的單因素分析 結直腸癌組織中MMR表達缺失與患者性別、腫瘤部位、腫瘤類型、T分期均無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與患者年齡、腫瘤直徑、分化程度、N分期、M分期、TNM分期均有關，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

表1 影響結直腸癌組織中MMR表達缺失的單因素分析[例（%）]

2.3 影響結直腸癌組織中MMR表達缺失的多因素分析 以MMR表達缺失為應變量，以單因素分析結果P＜0.05的因素為自變量進行logistic回歸分析，結果顯示腫瘤直徑、分化程度（低分化）是結直腸癌組織中MMR表達缺失的獨立影響因素，見表2。

表2 影響結直腸癌組織中MMR表達缺失的多因素分析

3 討論

在世界范圍內，結直腸癌發病率居所有惡性腫瘤的第3位，其病死率居所有惡性腫瘤的第4位，嚴重威脅著人類健康[8]。導致結直腸癌的外在不良因素主要有高脂、低纖維飲食等[9]。同時，其內在因素也不能忽視。繼1993年首次發現MMR基因以來，越來越多學者探索其與結直腸癌發生、發展的內在聯系。在正常機體內，存在著一套完整的修復系統，對維護基因的穩定性和完整性起著重要作用，如MMR系統等[10]。MMR系統能特異性地發現并矯正DNA堿基的錯配，避免基因發生突變，防止腫瘤的發生[11-12]。當MMR基因受到外界因素（如生物因素、溫度變化等）的干擾會發生突變，不能識別DNA復制過程中出現的堿基錯配，從而導致MSI的發生[13]。

目前對MMR基因的檢測方法主要有DNA測序法、免疫組化法。DNA測序法采用美國國立癌癥研究所推薦的一組微衛星標記點，即BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；當2個及以上分子標記顯示異常為高頻MSI，僅1個顯示異常為低頻MSI，無異常為微衛星穩定[14]。免疫組化法則是通過檢測MMR蛋白表達進行篩查。相比于DNA測序法，免疫組化法操作方便、價格實惠，被廣泛用于臨床[15]。

相關研究表明，MMR缺陷會影響腫瘤的生物學特征，如好發于右半結腸、傾向于低分化和黏液腺癌、較低的淋巴結轉移率及遠處轉移率[16-18]。同時檢測MMR蛋白表達，有利于為結直腸癌患者術后診療方案的制定及預后判斷提供參考[19-21]。有文獻報道，MMR正常的結直腸癌患者對程序性死亡受體單抗治療無效[22]。本研究結果發現，結直腸癌組織中MMR蛋白表達缺失率為20.2%，腫瘤直徑、分化程度是結直腸癌組織中MMR表達缺失的獨立影響因素。可見，部分結直腸癌患者中可出現MMR缺陷，且與腫瘤直徑、分化程度等存在一定的關系。檢測結直腸癌組織中MMR蛋白表達，有助于術后診療方案的制定與預后判斷，提高結直腸癌的診療水平。