N-糖酰胺酶PNGase H+ 最小糖結構作用底物的研究

胡孝春,王 婷,蔡志鵬,劉 麗,JOSEF Voglmeir

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210000)

N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparagines amidase,PNGase)是一種去糖基化酶[1]。它能催化N-糖鏈和天冬酰胺(Asn)殘基之間β-天冬氨?；咸前锋I的斷裂,從而將完整的N-糖鏈由蛋白質或多肽上釋放下來[2-4]。N-糖酰胺酶作為糖組學研究的重要工具酶,在糖鏈的結構分析和功能研究中都發揮著重要的作用[5-7]。然而,目前常用的兩種商業化N-糖酰胺酶PNGase A和PNGase F都各有不足:PNGase A可以釋放所有類型的糖鏈,但無法作用于糖蛋白,只能作用于糖肽;而PNGase F雖然對糖蛋白和糖肽都具有活性,但無法釋放植物來源的具有核心α-1,3巖藻糖修飾的N-糖鏈。本實驗室在前期研究中,從細菌Terriglobusroseus中發現了一種新型N-糖酰胺酶PNGase H+[8]。該酶能夠由原核系統重組表達,并克服了現有商業酶PNGase F和PNGase A兩者的缺陷。它不僅能夠作用于糖蛋白也能用于糖肽,且能夠釋放所有類型的N-糖鏈,包括具有植物特征性α-1,3巖藻糖核心結構的N-糖鏈,因此PNGase H+在植物來源的糖蛋白N-糖鏈結構分析中具有重要的應用價值[9]。

最小糖結構作用單元是N-糖酰胺酶的一個重要酶學特性,明確PNGase作用于N-糖鏈的具體識別位點以及催化所必須的糖鏈結構和糖分子數量,是深入研究N-糖酰胺酶酶催化機理的關鍵環節[10-12]。Altmann F發現,PNGase F能夠釋放的最小糖結構作用單元為與Asn相連的二乙酰殼二糖結構(N,N′-diacetylchitobiose),而PNGase A則僅需一個與Asn連接的N-乙酰葡糖胺結構,就能夠識別糖鏈并進行水解[13]。在之前的研究中,本實驗室雖然對N-糖酰胺酶PNGase H+的最適反應條件和底物特異性進行了研究,但由于缺乏合適的酶解底物,因此未對其最小糖結構作用單元進行探索。

合成具有不同糖鏈長度和結構的糖肽底物是研究PNGase H+最小糖結構作用單元的關鍵。目前常用的糖肽底物的合成方法主要有化學合成和酶法合成兩種?；瘜W合成容易破壞糖鏈結構,且通常伴有副產物生成[14-15],酶法具有高效性、特異的區域選擇性和立體選擇性的特點。Wong等[18]曾利用半乳糖基轉移酶催化反應,大批量合成了半乳糖胺。因此酶法可以獲得產率較高的目的產物[16-17]。本文中糖肽底物的合成擬采用糖基水解酶和糖基轉移酶的方法,糖基水解酶能夠特異性水解糖底物,從而獲得目標產物,而糖基轉移酶則能將糖基供體上的糖分子轉移到糖基受體上,從而獲得目標產物。

本研究擬以丹磺酰氯標記的糖肽標準品為基礎,利用酶法制備不同糖單元大小的糖肽底物,并以此底物對PNGase H+的活性進行檢測,得出PNGase H+的最小糖結構作用單元,從而為PNGase H+的酶催化機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-甘露糖苷酶重組質粒、E.coliBL21(DE3)感受態細胞、β-半乳糖基轉移酶重組質粒、UDP-葡萄糖-4-差向異構酶重組質粒、β-N-乙酰氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶 Sigma生物公司;丹磺酰氯標記的七糖單元糖肽GNGN(Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc4Man3)-Arg) 由奧地利維也納自然資源與生命科學應用大學的Thomas Dalik和Friedrich Altmann提供;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟、卡那霉素、Triton X-100、Ni-NTA親和層析柱、LB液體培養基(5 g NaCl、10 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨) 南京金絲瑞生物公司;乙腈 色譜純,默克公司。

1416R型高速冷凍離心機 珠海黑馬醫學儀器有限公司;GRP-9160型恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司;725N型微量分光光度計One Drop OD-2000 南京五義科技有限公司;Shimadzu LC-30AD型超高效液相色譜配有SPD-20A型紫外檢測器以及RF-20Axs型熒光檢測器、SIL-30AC型自動進樣器、CO-2000型柱溫箱(恒信儀器)、LC solution工作站 島津技邇(上海)商貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖肽合成相關酶的制備

1.2.1.1β-甘露糖苷酶的表達與純化 將β-甘露糖苷酶重組質粒轉化入E.coliBL21(DE3)感受態細胞[19]。挑取單菌落于5 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養基中過夜培養,然后接種至含有400 mL LB培養基的搖瓶中擴大培養,直至菌液濃度在OD600處吸光度達到0.5左右,加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L,18 ℃誘導表達22 h。4 ℃、4000 r/min離心收集菌體,將菌體沉淀重懸于10 mL裂解液(100 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1% Triton X-100,1 mmol/L苯甲基磺酰氟)超聲破碎細胞,12000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清,并置于80 ℃水浴鍋中加熱30 min,4 ℃、12000 r/min離心收集上清,并用分子截留量為30 kDa的超濾管對其進行濃縮,4 ℃保存。

1.2.1.2β-半乳糖基轉移酶的表達與純化 將β-半乳糖基轉移酶重組質粒轉化入E.coliBL21(DE3)感受態細胞,表達過程同1.2.1.1。使用Ni-NTA親和層析進行純化[20],鎳柱使用5倍柱體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris/HCl pH8.0,50 mmol/L NaCl)進行平衡后上樣,并使用10倍柱體積的結合緩沖液(50 mmol/L Tris/HCl pH8.0,50 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑)沖洗去除非特異結合的蛋白,再用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris/HCl pH8.0,50 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑)洗脫重組蛋白,280 nm波長檢測柱下液,收集蛋白峰即純化后的重組酶,4 ℃保存[21]。

1.2.1.3 UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的表達與純化 將UDP-葡萄糖-4-差向異構酶重組質粒轉化入E.coliBL21(DE3)感受態細胞,表達和純化過程同1.2.1.2,4 ℃保存。

1.2.2 丹磺酰氯標記糖肽底物的酶法合成

1.2.2.1 五糖單元糖肽的制備 取GNGN(10 pmol/μL)1 mL作為初始底物,加入1 μLβ-N-乙酰氨基己糖苷酶和250 μL pH為7.0的Tris/HCl緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養箱中反應16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結束反應[22],得五糖單元糖肽。

1.2.2.2 三糖單元糖肽的制備 以1.2.2.1中反應獲得的產物作為底物,取1 mL該底物置于EP管中,加入1 μLα-甘露糖苷酶和250 μL pH為5.5的檸檬酸緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養箱中反應16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結束反應,得三糖單元糖肽。

1.2.2.3 二糖單元糖肽的制備 以1.2.2.2中反應獲得的產物作為底物,取1 mL該底物置于EP管中,加入10 μLβ-甘露糖苷酶和200 μL 400 mmol/L pH為7.4的2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)緩沖溶液,振蕩混勻,于75 ℃金屬浴中反應10 min后,95 ℃滅活5 min結束反應,得二糖單元糖肽。

1.2.2.4 單糖單元糖肽的制備 以1.2.2.3中反應獲得的產物作為底物,取400 μL該底物置于EP管中,加入1 μLβ-N-乙酰氨基己糖苷酶和100 μL pH為7.0的Tris/HCl緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養箱中反應16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結束反應,得單糖單元糖肽。

1.2.2.5 新三糖單元糖肽的制備 以1.2.2.3中反應獲得的產物作為底物,取5 μL該底物置于EP管中,加入5 μL MgCl2(10 mmol/L)、1 μL MnCl2(100 mmol/L)、8 μLβ-半乳糖苷轉移酶、8 μL UDP-葡萄糖-4-差向異構酶及5 μL pH為7.4的AMPD(400 mmol/L)緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養箱中反應16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結束反應,得糖結構不同的新三糖單元糖肽。

1.2.3 丹磺酰氯標記糖肽底物的檢測 利用超高液相色譜對1.2.2所制備糖肽進行檢測。色譜柱:Phenomenex Kinetex? 1.7 μm C18 100? 150×2.10 mm;流動相A:超純水(含0.1%甲酸(v/v)),流動相B:乙腈(含0.1%甲酸(v/v));流速:0.25 mL/min;檢測波長:UV/Vis 436 nm;進樣量:30 μL;柱溫常溫。洗脫程序:0～1 min B 5%,1～30 min B 5%～50%,30～31 min B 50%～95%,31～32 min B 95%,32～33 min B 95%～5%,33～40 min B 5%,50 min結束程序。

糖肽底物定量分析:利用Labsolutions 軟件進行分析,以糖肽GNGN(10 pmol/μL)為外標,對制備底物的峰面積積分,計算底物濃度[13]。

1.2.4 N-糖酰胺酶PNGase H+對不同糖肽底物酶解活性的測定

1.2.4.1 N-糖酰胺酶PNGase H+的表達純化 N-糖酰胺酶PNGase H+的表達及純化步驟表達和純化過程同1.2.1.2,4 ℃保存。

1.2.4.2 PNGase H+對不同糖肽底物酶解活性的檢測 分別以五糖單元、三糖單元、二糖單元、單糖單元、三糖新單元糖肽作為反應底物,檢測PNGase H+的酶解活性,反應體系:2 μL糖肽底物、2 μL PNGase H+、2 μL pH為2.6的檸檬酸緩沖溶液和4 μL超純水;不加酶底物對照組:2 μL糖肽底物、2 μL pH為2.6的檸檬酸緩沖溶液和6 μL超純水;產物對照組:2 μL Dabsyl-Gly-Glu-Asn-Arg、2 μL pH2.6的檸檬酸緩沖溶液和6 μL超純水,振蕩混勻,分別置于37 ℃恒溫培養箱中反應16 h后,于金屬浴中95 ℃滅活5 min結束反應,12000 r/min常溫離心機中離心1 min,利用超高液相色譜進行檢測,色譜條件、試驗步驟同1.2.3。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel Office 2010數據整理,繪圖軟件采用Adobe illustrator進行色譜圖繪制。

2 結果與分析

2.1 丹磺酰氯標記的糖肽底物的合成

核心五糖結構(由2個N-乙酰葡糖胺及3個甘露糖構成)是所有種類N-糖鏈的共有結構,因此合成具有該糖單元結構以及在此基礎上產生的遞減糖單元結構的特殊糖肽類底物,是N-糖酰胺酶識別糖單元結構研究的基礎。本實驗以丹磺酰氯標記的七糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc4Man3)-Arg(GNGN)為起始底物,經β-N-乙酰氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶依序處理生成相應的五糖、三糖和二糖單元糖肽,再進一步使用β-N-乙酰氨基己糖苷酶處理產生單糖單元糖肽,所得產物分別由高效液相色譜檢測,結果如圖1所示。

圖1 五糖、三糖、二糖和單糖單元丹磺酰氯標記糖肽底物液相色譜檢測圖

七糖單元糖肽底物液相保留時間為21 min,經β-N-乙酰氨基己糖苷酶作用后,核心甘露糖結構上的末端β-N-乙酰氨基葡萄糖被完全水解,生成五糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg,其色譜峰出峰位置發生后移(保留時間21.5 min),所得產物純度為100%,濃度為8.3 pmol/μL。該五糖單元糖肽在α-甘露糖苷酶的作用下,末端的α-1,3和α-1,6連接甘露糖被完全解離,生成三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg,其色譜峰位置后移至22 min,所得產物純度為100%,濃度為7.0 pmol/μL。隨后在β-甘露糖苷酶的作用下,與二乙酰殼二糖相連的β-甘露糖被解離,生成二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg,保留時間為22.5 min,所得產物純度為100%,濃度為6.5 pmol/μL。最后再次經β-N-乙酰氨基己糖苷酶的作用,生成單糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg,部分色譜峰后移至23 min,所得產物純度約為70%,濃度為4.5 pmol/μL。

此外,為了保證最小糖單元結構研究的準確性,本實驗還以二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg為底物,通過β-半乳糖基轉移酶的作用,生成了一種非自然存在的三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg。根據液相色譜圖2所示,二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg的色譜峰液相保留時間為22.5 min,經β-半乳糖基轉移酶反應,生成新三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg(保留時間22 min),該三糖單元糖肽的純度為100%,濃度為6.5 pmol/μL。

圖2 新三糖單元丹磺酰氯標記糖肽底物色譜檢測圖

通過上述反應,制備了五種不同的糖單元糖肽,其名稱、結構和濃度如表1所示。這五種糖單元糖肽都是以核心五糖結構為基礎,在特異性糖苷酶的作用下,糖單元的數量或結構發生改變,從而合成了目標糖肽底物,為后續測定PNGase H+最小糖結構作用底物的探究提供了基礎。

表1 丹磺酰氯標記糖肽底物結構及濃度

2.2 N-糖酰胺酶PNGase H+對不同丹磺酰氯標記糖單元糖肽底物的酶解作用

2.2.1 PNGase H+對五糖單元糖肽的酶解作用 以五糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg為底物,檢測 PNGase H+對該底物的酶解效果。反應16 h后,產物通過液相色譜進行檢測,并與丹磺酰氯標記的Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg的液相圖譜進行比較,確定PNGase H+對五糖單元糖肽的酶解效果,檢測結果如圖3所示。底物五糖單元糖肽的色譜峰(保留時間21.5 min)發生完全偏移,生成的產物色譜峰(保留時間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠將五糖單元從糖肽上完全解離下來。已往對PNGase H+的底物特異性研究顯示,PNGase H+能夠作用于高甘露糖型、復雜型和雜合型所有種類的N-糖鏈[23],而核心五糖作為這些N-糖鏈的共有結構,PNGase H+也應對其具有酶解效果,本試驗結果進一步驗證了該結論。

圖3 PNGase H+對五糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.2 PNGase H+對三糖單元糖肽的酶解作用 以三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg為底物對PNGase H+的酶解作用進行測定,結果如圖4所示。反應16 h后,底物三糖單元糖肽的色譜峰(保留時間22 min)發生完全偏移,生成的產物色譜峰(保留時間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠將三糖單元糖肽上的N-糖鏈完全解離。在反應底物的制備過程中,通過α-甘露糖苷酶的作用,N-糖鏈結構五糖核心末端兩個α-連接的甘露糖被解離,只留下與核心N-乙酰殼二糖相連的β-甘露糖。這種三糖單元糖肽雖然不具備完整的五糖核心,但也是自然界存在的一種N-糖鏈結構,如曾有相關報道在大豆糖蛋白的N-糖鏈分析中鑒定出該結構[24]。試驗結果表明,即使消去了五糖核心的末端兩個α-連接的甘露糖,PNGase H+依舊能夠很好地識別,并釋放該糖鏈結構。

圖4 PNGase H+對三糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.3 PNGase H+對二糖單元糖肽的酶解作用 以二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg為底物對PNGase H+對酶解作用進行了測定,結果如圖5所示。反應16 h后,底物二糖單元糖肽的色譜峰(保留時間22.5 min)發生完全偏移,生成的產物色譜峰(保留時間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠將二糖單元糖肽上的N-糖鏈完全解離。該二糖單元底物在五糖核心結構基礎上,通過α-甘露糖苷酶和β-甘露糖苷酶的共同作用,所有甘露糖基均被解離,只留下核心N-乙酰殼二糖。試驗結果表明,即使只剩核心N-乙酰殼二糖結構,PNGase H+依舊能夠很好地識別并釋放該糖鏈結構,該結果與已往的報道一致。如Altman等發現,PNGase F和PNGase A均能水解連接有N-乙酰殼二糖的六肽底物[13]。晶體結構研究也證明,N-乙酰殼二糖能夠結合在PNGase F的活性中心[25]。此外Fan等發現,PNGase F對含有苯丙氨酸(Phe)氨基酸殘基的N-乙酰殼二糖糖肽活性極低[26]。這說明除了糖鏈結構與糖單元數量,肽段的氨基酸序列對于N-糖酰胺酶的酶解作用也有一定影響,而本實驗使用的糖肽底物中不含有苯丙氨酸,不會對PNGase H+的活性檢測造成影響。

圖5 PNGase H+對二糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.4 PNGase H+對單糖單元糖肽的酶解作用 以單糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg為底物對PNGase H+的酶解作用進行了測定,結果如圖6所示。前期制備的單糖單元糖肽純度僅為70%,其中還含有30%的二糖單元糖肽,加入PNGase H+反應16 h后,可見保留時間為22.5 min的二糖單元糖肽的色譜峰完全消失,同時保留時間24.5 min檢測到丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg,而單糖分子糖肽的底物色譜峰(保留時間為23 min)峰高和峰面積均無明顯變化,表明PNGase H+對單糖分子糖肽活性極弱,無法將N-乙酰葡糖胺從單糖分子糖肽上解離下來。PNGase F的晶體結構研究中顯示,酶活性中心谷氨酸殘基118位(Glu118)能夠與第二位N-乙酰葡萄糖胺6′位的氧形成氫鍵,從而提高對糖鏈的結合能力,由此可見第二位的N-乙酰葡萄糖胺對PNGase F的活性具有重要影響[25]。而本試驗結果表明,PNGase H+與PNGase F相似,能夠作用的最小糖鏈結構為N-乙酰殼二糖,而其酶活性中心是否存在氨基酸殘基能夠與第二位N-乙酰葡萄糖胺形成氫鍵,還需進一步的晶體結構研究驗證。

圖6 PNGase H+對單糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.5 PNGase H+對三糖新單元糖肽的酶解作用 為了進一步驗證N-乙酰殼二糖為PNGase H+的最小糖結構作用單元,以人工合成的非天然三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg為底物對PNGase H+的酶解活性進行了測定,結果如圖7所示。反應16 h后,底物三糖單元糖肽的色譜峰(保留時間22 min)發生完全偏移,生成的產物色譜峰(保留時間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠將該三糖單元糖肽上的N-糖鏈完全解離。自然存在的N-糖鏈構象中,與核心N-乙酰殼二糖相連的糖基一般是甘露糖而非半乳糖[27]。然而PNGase H+一樣能夠高效的水解釋放該種糖鏈,說明第三位的半乳糖基并未影響糖鏈與PNGase H+活性中心的結合,進一步驗證了PNGase H+的最小糖結構作用單元為N-乙酰殼二糖的推斷。

圖7 PNGase H+對三糖新單元糖肽酶解作用液相色譜圖

3 結論

本研究首先利用生物學的方法成功表達純化出了β-半乳糖苷酶和β-半乳糖基轉移酶,然后以磺酰氯標記的復雜型七糖單元糖肽標準品為初始底物,利用酶法合成獲得了5種不同結構的糖肽底物,以合成的底物為基礎,通過高效液相色譜來檢測PNGase H+對底物的酶解效果,從而得出N-糖酰胺酶PNGase H+的最小糖結構作用底物,實驗表明,利用酶法成功制備出了5種不同結構的糖肽底物Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2 Man)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg和Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg,濃度分別為8.3、7.0、6.5、4.5、6.5 pmol/μL。PNGase H+不僅能夠作用于糖單元數為二、三和五的三種不同的天然構象糖肽,且能夠作用于人工合成的非天然構象的三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg,但不能酶解只具有單個N-乙酰葡糖胺的糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg,由此推斷PNGase H+的最小糖結構作用單底物為帶有N-乙酰殼二糖的糖肽。