拉曼光譜技術在橄欖油摻偽及品質鑒定中的應用研究進展

黃 帥,王 強,應瑞峰,王耀松,胡飛杰,黃梅桂,,*

(1.南京林業大學輕工與食品學院,食品科學與工程系,江蘇南京 210037;2.重慶第二師范學院,脂質資源與兒童日化品協同創新中心,重慶 400067;3.南京市產品質量監督檢驗院,食品與食品添加劑國家中心,江蘇南京 210037)

初榨橄欖油是由初熟或成熟的油橄欖鮮果在采后24 h內通過物理壓榨工藝提取的木本植物油,由于提取過程中不經過任何熱及化學處理,橄欖油保留了其獨特的營養成分與感官特性,因此受到廣大消費者的喜愛。橄欖油的品質分析及摻偽鑒別一直是國內外研究的主題,目前市面上橄欖油的摻假主要分為兩類:一是優質橄欖油中摻入劣質橄欖油、橄欖果渣油;二是在橄欖油中摻入其它種類的油。高效液相色譜、氣相色譜、液相色譜串聯質譜、氣質聯用等傳統方法被廣泛應用于食用油的安全性分析,然而,由于樣品制備較為復雜且費時費力,這些方法難于應用于橄欖油生產過程中的在線監測。核磁共振(NMR)、近紅外光譜(NIR)、拉曼光譜(RS)等光譜技術由于樣品制備簡單、分析速度快且靈敏度高,是橄欖油品質鑒定的有力工具。與吸收峰較寬的紅外光譜不同,拉曼光譜的特征是一系列孤立的譜帶,并且對C=C的靈敏度較高,更適合分析食用油。本文介紹了拉曼光譜在橄欖油品質分析及摻假鑒別中的研究現狀,為橄欖油品質檢測提供了有用的信息,并對其在橄欖油安全分析中的應用前景進行了展望。

1 拉曼光譜概述

拉曼光譜是以1928年印度物理學家拉曼發現的拉曼散射效應為基礎發展起來的一種研究分子振動、轉動的光譜技術,它基于特征峰強度與含量具有良好相關性,且靈敏度高,是一種快速、無損、無污染的檢測技術。近年來,拉曼光譜技術的發展非常迅速,隨著拉曼光譜儀和光纖探頭的發展,拉曼光譜被應用到許多領域[1],食用植物油一直是拉曼光譜學研究的主題[2]。橄欖油是地中海飲食中脂肪的主要來源,是所有植物油中唯一以天然鮮果冷榨的食用植物油,并且與降低冠心病以及一些腫瘤的發病率有關,因而受到廣泛關注。在過去的幾十年里,光譜技術已經成為分析初榨橄欖油和其他類型植物油非常有利的工具,除紅外光譜和核磁共振外,拉曼光譜因其優秀的指紋能力和操作的便捷性被運用于食用植物油的分析[3-8]。

1.1 橄欖油檢測的研究現狀

橄欖油是由初熟或成熟的油橄欖鮮果通過物理壓榨工藝提取的天然果油,被認為是迄今唯一一種以自然狀態形式供人類食用的木本植物油,其品質在植物油中居于首位。油橄欖在地中海沿岸已有四千多年的栽培歷史,目前世界橄欖油主產國主要有西班牙、意大利、希臘等,我國于20世紀60年代開始引種橄欖樹,主要分布于云南、甘肅、四川等省份[9-11]。近年來,隨著生活水平的提高,人們越來越重視飲食的營養與健康,橄欖油也因其獨特的營養價值獲得了消費者的青睞。

目前對于橄欖油中成分及各項指標的檢測方法主要有感官檢驗、常規理化檢測、色譜檢測技術、光譜檢測技術等[12-14]。感官檢驗的方法雖然直觀、快速,但是受感官分析平臺及專業感官評定員的限制。常規理化檢測主要包括過氧化值、酸值和碘值的測定。油脂的酸值主要反映了油脂中游離脂肪酸的含量,根據橄欖油、油橄欖果渣油標準(GB/T 23347-2009)[15],橄欖油的酸值(以氫氧化鉀計)一般要求小于4 mg/g,而特級初榨橄欖油的酸值要求小于1.6 mg/g。其次,油脂的過氧化值、碘值也表征橄欖油的腐敗程度。常規理化檢測雖然結果比較準確,但是單一指標的測量不夠客觀,多指標的測量又比較復雜繁瑣,只能作為鑒別橄欖油品質的有效輔助手段[16]。色譜檢測技術主要包含了氣相色譜、高效液相色譜等,氣相色譜可用于橄欖油中的脂肪酸組成、含量、橄欖油中的生育酚、甾醇及一些風味物質和揮發性物質的檢測。高效液相色譜可用于檢測橄欖油中的多酚、黃酮類物質。色譜技術檢測靈敏度高、結果準確可靠,但是儀器較為昂貴、前處理復雜、耗時[17]。

光譜檢測技術是一種快速、簡便且低碳環保的技術,包括紫外-可見分光光度法、原子吸收法、紅外光譜法、拉曼光譜法等。目前食用油的檢測應用較多的是紅外光譜法和拉曼光譜法,紅外光譜是分子振動過程中偶極矩變化引起的,而拉曼光譜是分子振動過程中極化率的變化引起的。與紅外光譜相比,拉曼光譜的譜峰比較窄,指紋信息更加豐富,對C=C的檢測具有很高的靈敏度[18-19]。在分析分子的結構時,拉曼光譜與紅外光譜可以相互補充。一些紅外光譜無法檢測出來的信息可以在拉曼光譜中檢測出來[20],C=O、N-H、O-H等極性基團的紅外吸收較強,而C=C、C-C等非極性基團的拉曼譜帶強度大,因此拉曼光譜與紅外光譜配合使用可以更加全面地研究物質的結構[21-23]。

1.2 橄欖油的拉曼光譜特征信息

拉曼光譜是以拉曼散射效應為基礎發展起來的一種分子振動光譜,它的譜帶數目、頻率位移、譜帶強度都與分子的振動和轉動相關聯[24]。拉曼光譜研究的區域主要在800～1800和2750～3100 cm-1[25-26]。橄欖油的部分特征拉曼位移及特征峰所代表的官能團信息如表1所示[16,18,27],其中3005 cm-1是=C-H的對稱伸縮振動峰;2924 cm-1處是C-H的不對稱伸縮振動峰;2897和2850 cm-1是分別對應于CH3和CH2的C-H對稱伸縮振動峰;1760 cm-1是C=O的伸縮振動峰;不飽和脂肪酸的順式碳碳雙鍵[cis(C=C)]的基團振動峰位于1660 cm-1處;1525 cm-1處是C=C的伸縮振動峰;1440和1300 cm-1是C-H彎曲振動峰;1265 cm-1是=C-H彎曲振動峰;1008 cm-1是CH3的彎曲振動峰;1150、1082和868 cm-1是C-C的伸縮振動峰;960 cm-1與反式碳碳雙鍵[trans(C=C)]的彎曲振動相關。位移值為1265、1660和3005 cm-1處的拉曼峰與不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵有關[16,18]。這些帶的強度主要反映了總不飽和度并且與油的碘值相關。大約在1008、1150和1525 cm-1處的三個帶與類胡蘿卜素有關[28-30],這是不同品牌橄欖油主要特性變化的原因之一。拉曼光譜是一種分辨結構的有效手段,它可以在短時間內測量大量的樣品并且能夠顯示出良好的振動躍遷帶。近年來,拉曼光譜在食品分析中的應用越來越廣泛,特別是在食用植物油的分析方面,如:評估油的總不飽和度、橄欖油的品質的鑒定、檢測初榨橄欖油中的摻假、確定橄欖油中的微量成分及評估氧化穩定性[26]。

表1 橄欖油中主要拉曼峰的歸屬[16,18,27]

2 應用拉曼光譜法評估橄欖油的品質及分類鑒定

2.1 拉曼光譜法可快速有效評價橄欖油的不飽和度

拉曼光譜最早用于食用油分析是用于測定油的不飽和度(DU),測量不飽和度的方法主要是碘值(IV)法,指100 g油所吸收的碘離子的量,通常用氣相色譜法和Wijs碘法等化學方法來進行測定[26,31],然而這些傳統的化學方法較為復雜繁瑣,因此快速有效、操作簡便的拉曼光譜法逐漸體現出優勢[25,32-34]。由于不飽和度代表脂肪酸鏈中雙鍵的數目,評價不飽和度的方法可通過定量測量ν(C=C)譜帶強度及其與δ(CH2)剪切振動相關的譜帶強度的關系,可通過1660和1440 cm-1附近譜帶高度的比率來測定油脂的不飽和度[34-38]。

Bailey等[39]發現不飽和度與1620～1690 cm-1[ν(C=C)]和1420～1480 cm-1[δ(CH2)]范圍內的拉曼譜帶強度之間具有強相關性。El-Abassy等[40]使用1265和1300 cm-1處譜帶的相對強度比來確定不飽和度。Sadeghi-Jorabchi等[37]使用傅里葉變換拉曼光譜技術(FT-RS)在約1650 cm-1[ν(C=C)]和1440 cm-1[δ(CH2)]以及3010 cm-1[ν(=C-H)]和1270 cm-1[γ(=C-H)或ν(C-C)]處觀察到的譜帶強度來確定油和人造黃油的碘值,發現五種油與人造黃油的ν(C=C)與δ(CH2)的峰高比與碘值具有很高的相關性,而人造黃油中ν(C=C)與δ(CH2)的峰面積比與碘值的相關性更高。Dyminska等[41]提出了一種方法,使用在1650 cm-1[ν(C=C)]和2850 cm-1[ν(CH2)]處觀察到的紅外和拉曼譜帶的強度比確定食用油的碘值。紅外光譜在1650和2850 cm-1處譜帶的強度比與碘值的相關系數為0.988,拉曼光譜在1650和2850 cm-1處譜帶的強度比與碘值的相關系數為0.976。這些結果可說明碘值與不飽和度之間具有極好的相關性,由于不同食用油的拉曼光譜差異非常小,這些方法同樣可以用于橄欖油不飽和度以及碘值的測定。

3010 cm-1處的譜帶強度可用來估計總順式不飽和度[40]。Carmona等[25]使用拉曼光譜測定包括特級初榨橄欖油在內的12種植物油在3009～3013 cm-1[ν(C=C-H)]處的信號強度,每種油的不飽和度通過氣相色譜法測定出的單不飽和酸的組合比例加上雙不飽和酸比例的兩倍和三不飽和酸的三倍計算,碘值通過Hanus方法實驗確定。結果顯示不飽和度及碘值與拉曼信號相對強度的曲線是一條相關系數非常高的曲線(R2>0.98)。這些結果證實了拉曼光譜是一種準確測定橄欖油不飽和度的工具。Barthus等[42]通過拉曼光譜所估計的碘值與AOCS認證的滴定方法所得到的碘值非常接近。拉曼光譜檢測速度快且不需要使用其他試劑,可以作為一種快速有效檢測橄欖油不飽和度的方法。

2.2 拉曼光譜法在橄欖油氧化穩定性方面的研究

油脂的氧化,不但會降低其品質,還會對食品安全和消費者的健康產生不利影響。氧化酸敗是油脂敗壞的主要原因之一。不飽和脂肪酸由于含有雙鍵結構,容易被氧化,在氧化時可形成氫過氧化物(ROOH),氫過氧化物容易繼續轉化為共軛醛、酮、共軛二烯和三烯、飽和環氧化合物以及α,β-不飽和環氧化合物等物質,從而降低油的感官品質和營養質量[43]。過氧化值是衡量油脂酸敗程度的指標之一,確定油脂過氧化值的方法主要包含兩步,先將過氧化物與過量的碘離子反應,再使用硫代硫酸鈉的標準溶液滴定得到的碘[26]。歐盟設定了特級初榨橄欖油最大耐受氧化程度的參數K232和K270,分別代表232和270 nm處的吸光度[26,43],232和270 nm處的吸光度值分別與共軛二烯和三烯的含量有關[44]。茴香胺值與油中醛、酮、醌等二級產物的含量密切相關,也是評估油脂氧化程度的重要參數[45]。

表2 拉曼光譜用于評估橄欖油的品質

由于振動光譜中含有大量的分子結構的信息,拉曼光譜可用于監測脂質氧化和評估橄欖油的氧化穩定性[46-49]。油受熱分解后結構發生改變因而會改變其特征拉曼譜帶。隨著加熱時間的增加,1640 cm-1處代表降解產物形成(主要是醛)的譜帶強度逐漸增加;不飽和度和碘值在逐漸降低,主要表現在1267和3015 cm-1處的峰強度逐漸下降[44,47]。初榨橄欖油在1525 cm-1處的譜帶是由類胡蘿卜素等高度共軛化合物的C=C的伸縮振動引起的。類胡蘿卜素被認為是初榨橄欖油中的特有成分,具有抗氧化的性質,隨著橄欖油精煉過程的加劇而逐漸被破壞。El-Abassy等[40]使用拉曼光譜監測特級初榨橄欖油中類胡蘿卜素在微波加熱和傳統工藝加熱時的降解,結果顯示:使用拉曼光譜預測的類胡蘿卜素的含量與使用標準方法測量的實際值之間有完美的線性關系(R2=0.99),且加熱時間越長,對橄欖油中的類胡蘿卜素的損害越大。Muik等[44]研究了包括初榨橄欖油在內的六種食用油在160 ℃下加熱9 h后的化學變化,加熱90 min后類胡蘿卜素所在峰(1525 cm-1)消失,表明這段時間是初榨橄欖油的穩定期。Muik等[44]發現拉曼光譜中1693 cm-1處的譜帶強度與茴香胺值之間存在很高的相關性(R2=0.96),K270和1635 cm-1處的譜帶強度之間也存在良好的相關性(R2=0.92),這也證明了1635 cm-1處的譜帶與共軛三烯有關。由于所研究的六種油的拉曼光譜之間的最大差異是在1620、1680和1655 cm-1出現的C=C伸縮振動的差異,Muik等人使用1620和1680 cm-1之間的面積與1655 cm-1處譜帶強度的比值(A1620-1680/I1655)來監測植物油的氧化,因為它能反映出油脂在氧化過程中含有共軛二烯和三烯以及異構化的化合物的形成。Guzman等[43]使用低分辨率拉曼光譜結合化學計量法評估橄欖油的氧化穩定性,結果表明:低分辨率拉曼光譜可以快速、無損、直接地確定橄欖油氧化狀態的關鍵參數(如過氧化值、K232和K270),是評價橄欖油氧化狀態的一種有效方法。

2.3 拉曼光譜檢測橄欖油中其他成分并對其進行分類和鑒定

植物油中不皂化物含量的高低,可以表征油脂的純度和摻雜情況,是鑒定油脂品質的指標之一。植物油的不皂化物含量約占0.2%～2%之間。目前,拉曼光譜已經可以用于橄欖油中不皂化物(如碳氫化合物、甾醇、萜烯醇、多酚)的檢測。Baeten等[29]應用拉曼光譜結合化學計量學方法對角鯊烯、甾醇和萜烯醇等各種組分進行拉曼光譜鑒別。Paiva-Martins等[50]首先使用拉曼光譜結合密度泛函理論(DFT)對橄欖油中的羥基酪醇等酚類物質進行了表征和分析,證明了拉曼光譜是一種快速、無損鑒定酚類化合物的非常有前途的工具。

拉曼光譜還可用于測定橄欖油中的游離脂肪酸的含量[28,51]。El-Abassy等[28]使用拉曼光譜法結合多變量分析來確定特級初榨橄欖油中游離脂肪酸(FFA)的含量。對于不同的光譜區域建立了通過滴定獲得的實際FFA%與基于拉曼光譜的預測值的校準曲線,在包含類胡蘿卜素的945～1600 cm-1區域建立的回歸曲線的斜率接近1,表明使用拉曼光譜的預測FFA值與使用滴定法的實際值之間的完美線性關系,同時也表明了FFA含量與類胡蘿卜素有很強的相關性。

表3 拉曼光譜技術用于橄欖油的分類和鑒定

油橄欖的品質受到產地、品種和成熟度等多種因素的影響,橄欖油的感官和營養也會受到這些因素的影響。不飽和度、碘值、過氧化值、游離酸度等參數是影響橄欖油品質的重要因素,這些參數可以通過拉曼光譜進行預測并對橄欖油進行分類和鑒定。Gouvinhas等[19]利用短波長拉曼光譜結合主成分分析(PCA)、判別分析(DA)、主成分回歸(PCR)和偏最小二乘回歸(PLS-R)對不同成熟階段的三個品種的橄欖所獲得的橄欖油進行研究,評估和量化品種與其成熟度之間的統計學差異。結果顯示:所研究的模型呈現出高的相關系數(R2>0.9333)。對于過氧化值的測定,PLS-R導致的測定誤差低于PCR,而兩種方法所獲得的結果在游離酸度方面非常相似。拉曼光譜結合多元分析法可以用于監測特級初榨橄欖油中的游離酸度和過氧化值,以及區分成熟油和非成熟油。Marinas等[52]利用拉曼光譜結合偏最小二乘法(PLS)和判別分析對橄欖油進行定量和定性分析,PLS模型在收獲年份、橄欖品種、地理起源和PDO方面分別得到了94.3%、84.0%、89.0%和86.6%的正確分類。利用拉曼光譜預測的多不飽和脂肪酸(PUFA),單不飽和脂肪酸(MUFA)和飽和脂肪酸(SFA)含量與實測值的誤差都非常接近于0。

Muik等[51]利用傅里葉變換拉曼光譜結合PLS校準模型對橄欖油和橄欖中的游離脂肪酸含量進行預測,橄欖油的預測均方根誤差(RMSEP)為0.29%,橄欖果實的預測均方根誤差為0.28%。根據歐盟的規定,預測的游離脂肪酸含量用于不同類別的橄欖油和橄欖果實的分類。90%的油樣和80%的橄欖果實被正確分類。這種方法非常簡單便捷,可用于在線監測生產的橄欖油,并且這種方法可以在橄欖油加工前基于FFA含量對橄欖果實進行分類。此外,Muik等人[45]還利用傅里葉變換拉曼光譜和模式識別技術對橄欖果實的品質進行鑒別,這種測量方法能夠直接作用于橄欖果實,因此可以根據橄欖果實的質量對其進行篩選,從而優化優質橄欖油的生產。

3 拉曼光譜用于橄欖油的摻偽鑒別

橄欖油因其感官品質和營養特性受到了大多數消費者的青睞,目前市面上橄欖油的摻假主要分為兩種:一是優質橄欖油中摻入劣質橄欖油、橄欖果渣油;二是在橄欖油中摻入其它種類的油,如榛子油、玉米油、葵花籽油、地溝油等。拉曼光譜法具有快速、精確、靈敏度高的特點,目前已廣泛應用于橄欖油的摻偽識別。通過拉曼光譜分析食用油中的成分及其含量可以定量或者定性鑒別劣質食用油[16]。由于不同植物油之間的光譜差異非常小,通常會結合主成分分析、聚類分析、判別分析、偏最小二乘法等化學計量法來對光譜數據進行統計分析。在這些方法中,主成分分析是通過少數幾個主成分來揭示多個變量間的內部結構,即從原始變量中找出少數幾個主成分,使其盡可能多地保留原始變量的信息,是一種區分光譜非常有力的工具,Zhang等[53]使用拉曼光譜以及主成分分析法準確地確定橄欖油中摻入5%或更多其他類型的油。通過拉曼光譜技術和化學計量法,可以實現初榨橄欖油與其他食用油的區分以及橄欖油的摻假檢測和定量分析[54-63]。周秀軍[24]提出了一種基于最小二乘支持向量機(LS-SVM)的拉曼光譜快速鑒別法。這種方法能實現最低摻雜量為5%左右橄欖油摻雜其他植物油的鑒別。Yang等[64]比較了拉曼光譜與近紅外和中紅外光譜在檢測橄欖油和橄欖油混合物中的效率,雖然這三種技術都成功定量了特級初榨橄欖油中渣油的含量,但拉曼光譜的相關系數最高(R2=0.997),預測的標準誤差最低(1.72%)。這些結果進一步證明了拉曼光譜在橄欖油摻雜鑒別中的潛力。類似的,Mendes等[61]通過近紅外(NIR)、中紅外(MIR)和拉曼光譜(Raman)技術分析橄欖油和大豆油的混合物以評估橄欖油的摻假,三種技術的均方根誤差分別為1.76%(NIR),4.89%(MIR)和1.57%(Raman),測定系數R2均大于0.98,這種方法對橄欖油中大豆油的摻假檢測是非常有效的,并且時間短,成本低,沒有復雜的前處理程序。

表4 拉曼光譜技術用于橄欖油摻偽鑒別

拉曼光譜結合化學計量法雖然能夠準確的實現對特級初榨橄欖油的摻偽鑒別,但是需要經過繁瑣的數據處理并且需要專業的化學計量學知識,所以拉曼光譜在橄欖油摻偽鑒別方面的技術仍然需要改進。目前國內外已有直接通過拉曼譜圖對橄欖油進行摻偽鑒別的研究,主要基于橄欖油的不飽和度和1525 cm-1處類胡蘿卜素的含量對橄欖油是否摻偽進行研究。不飽和度可用于橄欖油的摻假檢驗,主要在2995～3050、1600～1700和1200～1400 cm-1這三個區域進行判斷,如前所述,這三個區域的譜帶強度與不飽和度之間的相關系數特別高,理論上最適合檢測橄欖油的摻假。Carmona等[65]使用拉曼光譜所預測的不飽和度來區分澳洲堅果油、山核桃油、玉米油和葵花籽油,發現2995～3050、1600～1700和1200～1400 cm-1處的譜帶強度與澳洲堅果油中添加玉米油或葵花籽油的比例呈極顯著相關(R2>0.99),證明了拉曼光譜可以通過不飽和度對油脂的摻假進行檢測,由于橄欖油的不飽和度較高,這種方法同樣可以用于橄欖油的摻假鑒別。

橄欖油的拉曼光譜在1525 cm-1處的峰是由類胡蘿卜素等高度共軛化合物的C=C的伸縮振動引起的。類胡蘿卜素會在精煉的過程中消失,所以它們只存在于初榨橄欖油中,因此類胡蘿卜素的含量可用于橄欖油的摻偽鑒別,摻入劣質油或果渣油會使橄欖油中類胡蘿卜素的含量降低。張朝暉等[18]使用便攜式拉曼光譜對80余份橄欖油樣品和摻入不同質量分數果渣油的特級初榨橄欖油進行分析,發現75%的特級初榨橄欖油樣品在1265 cm-1處的拉曼光譜強度低于540,而高于540的橄欖油可能存在等級造假,在特級初榨橄欖油中摻入果渣油,會使1265和1650 cm-1處的拉曼峰強度增加,1525 cm-1處的峰變小直至消失。與使用化學計量學的方法相比,譜圖更加直觀、方便且無需計算。Zou等[57]基于拉曼光譜振動帶的強度比,特別是在1441 cm-1(-CH2-)處歸一化的順式=C-H和順式-C=C-的強度比來檢測橄欖油的摻偽,該方法能準確區分純橄欖油與含有5%或更多其他食用油(如大豆油、菜籽油、玉米油等)的橄欖油。與傳統的PCA方法相比,該方法更直觀、精確、簡單高效。

4 結論和展望

拉曼光譜基于特征峰強度與含量具有良好相關性且靈敏度高,通過拉曼光譜可預測橄欖油的不飽和度、碘值、過氧化值、游離酸度等參數,可對橄欖油的品質進行一系列的分析。拉曼光譜還可用于橄欖油的摻假鑒別,由于不同植物油之間的差異非常小,通常需要結合化學計量法才能進行判斷,雖然結果準確,但卻需要經過繁瑣的數據處理和專業的化學計量學知識,基于橄欖油的不飽和度及類胡蘿卜素的含量直接對其進行摻偽鑒別則更加簡單、直觀。拉曼光譜方法無需樣品制備,僅在幾秒鐘內即可完成,適合現場使用,尤其是質量監管部門以及企業生產等領域的質量預測與控制。橄欖油的脂肪酸組成、特征風味物質及多酚類物質的含量會隨著油橄欖的產地、生長環境、品種及成熟度等因素的變化而變化,可使用大量的樣品建立光譜數據庫,再結合化學計量法對光譜數據進行統計分析,從而對橄欖油進行分類鑒定。這些方法不僅可以用于橄欖油,還可用于橄欖果實的品質鑒定,在生產前對橄欖果實進行分類篩選,用以生產優質橄欖油。近幾年儀器的發展和檢測技術的提高解決了很多問題,如:傅里葉變換拉曼光譜技術可以消除熒光背景;顯微拉曼光譜分析技術可以消除雜散光;便攜式拉曼光譜可用于橄欖油的現場檢測分析,更為方便。隨著技術的發展,拉曼光譜在橄欖油中的應用也會越來越廣泛。