QuEChERS EMR-Lipid技術結合LC/MS/MS快速篩查與確證豬肉中55種獸藥殘留

黃澤瑋,閔宇航,杜 鋼,黃 瑛,王 穎,劉忠瑩

(四川省食品藥品檢驗檢測院,四川成都 611731)

食品安全是食品工業健康快速發展的前提,而目前我國食品安全問題卻不容樂觀,其中獸藥殘留問題嚴重危害著公共衛生安全及人體健康[1]。獸藥的種類有很多,主要包括促生長素、抗生素類、抗寄生蟲類等多種藥物,其在預防、治療、診斷動物疾病中發揮重要作用。過量殘留的獸藥可通過食物鏈進入人體內,對人體健康造成損傷[2]。因此嚴格監控動物源性食品中獸藥殘留具有重要意義。

隨著獸藥濫用越來越嚴重,檢驗人員也面臨巨大的挑戰:每檢驗幾個或一類化合物就需要更換一種前處理方法和檢測方法,耗費極大的人力、物力、財力和時間。同時動物源性食品種類多,基質復雜且差異大,檢測對象多,是食品中獸藥殘留處理和檢測的難題。近年來,獸殘檢測的相關文獻中,前處理方法主要有:固-液萃取法[3-4]、固相萃取法[5-7]、、基質固相分散技術[8-10]和QuEChERS[11-13]等,檢測技術有:高效液相色譜法[14-15]、液相色譜-串聯質譜法[16-17]、液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法[18-19]等。其中近兩年新推出的增強型除脂分散凈化劑(Enhanced Matrix Removal-Lipid,EMR-Lipid)是一種根據油脂類成分及大多數目標分析物結構特點設計的增強型脂質去除的QuEChERS凈化材料,對長鏈結構物質(如磷脂、游離脂肪酸、甘油三酯等)具有強大的吸附作用,能有效降低高脂肪含量基質對目標成分的干擾[20]。目前該技術還未見用于豬肉中多獸殘檢測的報道。

本文選擇了55種易出現濫用的獸藥(包括喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素、頭孢類抗生素、β-受體激動劑、抗寄生蟲藥等)作為研究對象,以豬肉作為研究基質,運用QuEChERS EMR-Lipid結合液質聯用,建立豬肉中55種獸藥殘留的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿苯達唑-2-氨基砜、2-氨基氟苯咪唑、5-羥基甲苯咪唑、阿維菌素、阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、金剛烷胺、噻苯咪唑酯、頭孢孟多鋰、頭孢他美酯、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢噻呋、環丙沙星、克倫特羅、氯羥吡啶、氯丙那林、丹諾沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、依普菌素、芬苯達唑、倍硫磷亞砜、氟羅沙星、氟甲喹、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、萘啶酸、奧比沙星、奧芬達唑砜、奧苯達唑、惡喹酸、培氟沙星、噴布特羅、吡羅昔康、普萘洛爾、沙拉沙星、司帕沙星、磺胺苯酰、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲氧嗪、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺喹惡啉、替諾昔康、三氯苯達唑、妥布特羅、泰樂菌素 標準品,阿爾塔科技有限公司,濃度為100 μg/mL,溶劑為甲醇;乙腈、醋酸銨 色譜級,飛世爾化學(Fisher Chemical);甲酸 優級純,上海安譜科學儀器有限公司(Anpel);增強型除脂分散凈化管(EMR-Lipid dSPE,1 g/15 mL)、增強型除脂萃取鹽包(EMR polish,3.5 g)、陶瓷均質子 美國安捷倫科技公司(Agilent)。

1290-6460超高壓液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀 美國安捷倫科技公司(Agilent);CP225D電子分析天平 德國賽多利斯公司(Sartorius);MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾公司(Thermo Fisher);TurboVap LV全自動氮吹濃縮儀 美國拜泰齊公司(Biotage);MS3漩渦混勻儀 德國艾卡儀器設備有限公司(IKA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相條件 色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm),流速0.5 mL/min。流動相為0.2%甲酸水溶液(A相)-0.2%甲酸乙腈(B相),梯度洗脫:0 min(A相98%:B相2%,后同)→0.5 min(98∶2)→1.8 min(85∶15)→3.5 min(80∶20)→6 min(75∶25)→7 min(70∶30)→11 min(65∶35)→16 min(0∶100)→26 min(0∶100)→27 min(98∶2)→30 min(98∶2);柱溫:40 ℃;進樣量:15 μL。

1.2.2 液相條件的優化

1.2.2.1 流動相的選擇 通過查閱文獻[21-23],在多獸殘分析中,普遍采用水-乙腈體系作為流動相,另外添加少量的易揮發酸可提高離子化效率,改善峰性。因此分別考察了0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液-0.1%甲酸乙腈這3種流動相對各化合物峰性及響應的影響。

1.2.2.2 色譜柱的選擇 為了獲得最佳的分離效果和最短的分離時間,考察Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm,2.2 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)和 Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)三款色譜柱對待測化合物的分離效果。

1.2.2.3 梯度洗脫的優化 通過調節梯度,優化各化合物的出峰,同時對同分異構體進行分離。存在的三組同分異構體分別為磺胺甲氧噠嗪與磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪與磺胺二甲異噁唑以及吡羅昔康與奧芬達唑砜。

1.2.3 質譜條件 采用電噴霧離子源(Electron Spray Ionization,ESI),正離子模式,檢測方式為dMRM,電離電壓為3.5 kV,干燥氣流速為13 L/min,干燥氣溫度為150 ℃,鞘氣流速為12 L/min,鞘氣溫度為300 ℃,霧化器流量為35 psi。各化合物質譜參數見表1。

表1 55種化合物質譜參數

續表

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 提取 稱取勻質后的豬肉約5 g,于50 mL具蓋塑料離心管中,先加入10.0 mL 提取試劑,再加入兩粒陶瓷均質子,渦旋(2000 r/min)混勻 5 min,離心5 min(4000 r/min)。

通過查閱文獻[25-27],多獸殘分析中多采用乙腈、甲醇等有機試劑作為提取試劑,對高脂肪高蛋白的基質可有效提取目標化合物,降低基質的干擾。與甲醇相比,乙腈提取時帶入的極性干擾物更少,有利于后續凈化。由于大部分目標化合物多帶有含氮基團,具有一定弱堿性,在提取溶劑中適量添加甲酸可提高這類化合物的提取效率。通過實驗考察1%、2%、5%、8%甲酸乙腈對55種化合物的提取效率。

1.2.4.2 凈化 參考文獻[28],移取5.0 mL離心后上層提取液到已活化的EMR-Lipid dSPE管(活化方式:移取5.0 mL 5 mmol/L醋酸銨水溶液到15 mL EMR-Lipid dSPE管中,快速振搖并渦旋2 min(2000 r/min),即可),快速振搖并渦旋2 min(2000 r/min),離心5 min(4000 r/min),將上層液完全傾倒入50 mL離心管中,加入兩粒陶瓷均質子及EMR polish粉包,快速劇烈振搖并渦旋2 min(2000 r/min),離心5 min(4000 r/min)。

1.2.4.3 濃縮 精密移取2 mL上層乙腈液至12 mL氮吹管中,加入0.050 mL二甲亞砜,40 ℃下氮氣濃縮至約0.050 mL;用15%乙腈水溶液補齊至1 mL,渦旋10 s(2000 r/min),超聲10 s,渦旋1 min(2000 r/min);將溶液倒入1.5 mL離心管中,離心2 min(10000 r/min),移取上層液至進樣小瓶中,待分析。

1.2.5 方法學驗證

1.2.5.1 基質標準曲線的繪制 精密量取55種化合物的標準品各100 μL,置于同一10 mL量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,作為混合標準品儲備液(各化合物濃度為1000 ng/mL)。分別精密移取混合標準品儲備液0、5、25、50、100、500、1000 μL至50 mL離心管中(最終濃度分別為0、1.25、6.25、12.5、25、125、250 ng/mL),氮氣吹至近干。選取陰性豬肉作為空白基質,分別稱取7份(每份5 g),置于上述已加入標準品的離心管中,然后按照樣品前處理方法進行操作。以各化合物濃度為橫坐標,各化合物定量離子峰面積為縱坐標,繪制基質標準曲線。

1.2.5.2 定量限考察 在確定定量限的研究中,在保證準確定性的前提下,以空白基質將混合標準品儲備液分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625 ng/mL來考察定量限。將擬定的定量限通過加標回收的方式考察定性結果、精密度和回收率,在保證定性準確、絕大部分化合物精密度<15%、回收率70%～130%之間的前提下確定定量限。

1.2.6 考察準確性與重復性 以豬肉作為基質,進行添加回收實驗。按照1、10、100 μg/kg三水平進行加標回收試驗,各水平制樣6份。準確性以測出量對理論添加量的百分比值計算平均回收率表示,重復性以測出量的RSD表示。

1.3 數據處理

將獲得的數據文件導入Agilent MassHunter Quantitative Analysis(for QQQ)軟件進行數據處理。以化合物保留時間作為篩查依據,以離子對豐度比作為確證依據,進行定性判斷;通過繪制標準曲線后,將樣品中各化合物峰面積帶入標準曲線后獲得各化合物的濃度,以獲得定量結果。

2 結果與分析

2.1 液相條件及優化

2.1.1 流動相的選擇 通過比較3種流動相:0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸乙腈,0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液-0.1%甲酸乙腈,其中添加了甲酸銨后部分化合物會出現峰性變差的情況;0.2%甲酸體系中各化合物的響應和分離效果普遍優于0.1%甲酸體系。因此最終采用含0.2%甲酸溶液-0.2%甲酸乙腈作為流動相。

2.1.2 色譜柱的選擇 對比三款色譜柱,前兩款的分析時間均較短,但由于出峰靠前的化合物(如雙氟沙星)峰性變差,而Agilent Eclipse Plus C18對55種化合物均有良好的峰性,因此選其作為分析柱。

2.1.3 梯度洗脫的優化 通過調節梯度,對三組同分異構體進行分離。其中吡羅昔康和奧芬達唑砜產生的二級碎片均不同,不會相互影響定性和定量。但其他兩組由于均為磺胺類化合物,會產生相同的碎片。因此在設計梯度洗脫時,需考慮這兩組化合物的完全分離。前11 min,選擇使用較緩的梯度以使這兩組化合物徹底分離。同時,由于55種化合物中44種均在前11 min出峰,11 min后將梯度在5 min之內升到有機相比例100%,并保持10 min,使難洗脫的化合物和基質均能洗脫出來,避免對后續進樣的干擾。圖1為該條件下總離子流圖,可見在此色譜條件下,55種化合物均分離較好。

圖1 55種化合物總離子流圖

2.2 質譜條件

根據歐盟2002/657/EC法案,質譜確證需最低4個識別點數。對于低分辨質譜,母離子的識別點數記為1,每個特征子離子識別點數記為1.5,因此,需至少1個母離子和2個子離子才能滿足4個識別點數的要求。由于在實際的樣品加標中存在基質對部分化合物定性造成的干擾,包括阿維菌素、阿苯達唑砜、金剛烷胺等20種化合物。因此這部分化合物選擇了1個母離子和3個二級子離子以確保定性的準確。

圖2 丹諾沙星提取離子流圖

圖3 丹諾沙星質譜圖

圖4 磺胺二甲嘧啶提取離子流圖

圖5 磺胺二甲嘧啶質譜圖

2.3 樣品前處理

考察1%、2%、5%和8%的甲酸乙腈對各化合物的提取效率。結果發現5%甲酸乙腈作為提取溶劑,大部分化合物回收率均在70%～120%之間。而當酸度較低或過高時,磺胺類化合物回收率均會偏低。

圖6 不同酸度對目標化合物回收率的影響

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性與定量限 由線性及定量限結果(見表2)顯示,各化合物在1.25～250 ng/mL線性范圍內線性良好,相關系數r均≥0.998。定量限均為1 μg/kg。本實驗未采用信噪比的方式來確定定量限,原因在于磺胺甲基異噁唑、磺胺甲基嘧啶、氯羥吡啶等化合物在信噪比為10時,定性結果出現假陰性的情況,同時也會出現回收率和精密度不能滿足定量分析的要求的情況,比如磺胺甲基嘧啶回收率僅48%,RSD僅32%。

表2 55種化合物線性、定量限、準確度及精密度

續表

2.4.2 準確性與重復性 結果見表2,95%化合物各添加水平的平均回收率為70.0%～130.0%,94%化合物重復性<15%;全部化合物的回收率為60.5%～139.5%,RSD為1.0%～20.1%。方法的準確度和重復性均滿足定量分析的要求。

2.5 實際樣品測定

在市場上采購豬肉18批次,按照所建立的方法進行測試,結果未發現陽性樣品。

3 結論

本文首次將QuEChERS EMR-Lipid與LC/MS/MS聯用技術用于豬肉中多獸藥殘留的快速篩查和確證。采用5%甲酸乙腈作為提取溶劑,經EMR-Lipid凈化后,通過Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)在30 min內完成對55 種化合物的分離,由液質聯用儀在正離子及dMRM模式下采集數據,最終由數據處理軟件通過保留時間及離子對豐度比進行快速篩查和確證,并采用基質匹配標準曲線定量。所建立的多獸殘分析方法,在1.25～250 ng/mL范圍內線性良好,相關系數r均≥0.998,定量限均為1 μg/kg,在1～100 μg/kg加標回收中,回收率在60.5%～139.5%,RSD在1.0%～20.1%,準確度和重復性符合定量分析的要求。本方法可實現同時分析55種獸殘化合物,大大提高了檢驗效率,為檢驗人員提供了一個簡單、快捷、高效的檢驗方法,也為食品安全提供了技術保障。