細辛多糖的提取工藝優化及細胞衰老保護作用

任 婷,宋天一,牟瑩瑩,許夢然,滿枋霖,孫 新,*

(1.北華大學藥學院,吉林吉林 132013;2.吉林省分子醫學老年重點實驗室,北華大學醫學院,吉林吉林 132013)

血管疾病如腦梗塞、心肌梗塞、冠狀動脈鈣化的發病率及死亡率逐年攀升并趨于年輕化[1]。血管衰老是促進心血管疾病發生發展的重要危險因素[2-3],與平滑肌細胞的健康密切相關[4-5]。血管平滑肌細胞是構成血管壁組織結構及維持血管張力的主要細胞成分[6],其血管和功能的改變是導致高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等多種心血管病的細胞病理學基礎[7-8]。研究血管平滑肌細胞的衰老作用對心腦血管疾病的診斷及治療具有重大意義。依托泊苷(Etoposide,Eto)是一種阻礙DNA修復的細胞周期特異性抗腫瘤藥物[9],使細胞周期阻滯于G1期發揮作用[10-11],通過DNA損傷誘導細胞衰老。

細辛為馬兜鈴科多年生草本植物北細辛(AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var. mandshuricum(Maxim.)Kitag.)、漢城細辛(AsarumsieboldiiMiq. var.seoulense Nakai)或華細辛(AsarumsieboldiiMiq.)的干燥根和根莖[12-13],《神農本草經》中被列為上品[14],有“小毒”[15],細辛主要活性成分有:多糖、甲基丁香酚、黃樟醚、馬兜鈴酸、生物堿以及一些微量元素[16-22]。細辛生物堿和醇提液對心血管系統具有強心、降壓、擴張血管、松弛平滑肌、增強脂質代謝等作用[23-25]。

本課題組長期從事多糖抗衰老活性組分篩選工作,衰老標記物β-半乳糖苷酶檢測模型發現細辛多糖(Asarumpolysaccharides,ASP-1)具有抗衰老活性。現有文獻中,細辛多糖的提取為簡易的熱水提取法[26-27],未見響應面法優化細辛多糖提取工藝及細辛多糖對血管平滑肌細胞衰老保護作用的報道。因此,本文采用響應面法優化細辛多糖提取工藝,采用Eto作為衰老誘導物,探討ASP-1對其誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞(Rat aortic smooth muscle cells,A10)衰老的保護作用,旨在為細辛的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細辛根部 長白山特色植物種植基地,按照中華人民共和國藥典標準鑒定;大鼠主動脈平滑肌細胞(A10) 北京中原合聚經貿有限公司;DEAE-纖維素 英國Whatman公司;Sepharose CL-6B 美國GE公司;單糖 標準品,中國食品藥品檢定研究院;DMSO 美國Sigma公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司;DMEM、胎牛血清 美國Gibco公司;MTT 美國Amresco公司;其它試劑 均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細辛多糖提取的工藝流程 將干燥的細辛根粉碎稱重,80%乙醇回流脫脂24 h。選擇適當的提取溫度、提取時間和液料比,將殘渣熱水浸提,得到的粗提液濾過后在30～70 ℃、真空度-0.03～-0.09 MPa下減壓濃縮至一定體積。連續劇烈攪拌下緩慢加入4倍體積無水乙醇,4 ℃靜置過夜,3500 r/min離心沉淀多糖,依次用無水乙醇、乙醚洗脫干燥得粗多糖。將粗多糖溶于蒸餾水配制成5%的糖溶液,-80 ℃冰箱反復凍融離心去蛋白質,接著向糖溶液中加入適當體積的鏈霉菌蛋白酶消化4～24 h,按體積比4∶1加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)劇烈振蕩1 h,3500 r/min離心取上清,重復至無變性蛋白質出現。截留分子量3500 Da透析除去小分子物質,冷凍干燥得到細辛多糖。根據下式計算細辛多糖得率:

式中:m多糖為提取出的細辛多糖的質量,m細辛為多糖對應的細辛原材料的質量。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1多糖提取工藝流程,研究提取溫度、液料比、提取時間 3個因素對細辛多糖得率的影響。

1.2.2.1 提取溫度對細辛多糖得率的影響 在提取時間為2 h、液料比為30∶1 mL/g的條件下,提取溫度分別設定為60、70、80、90、100 ℃,考察不同提取溫度對細辛多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取時間對細辛多糖得率的影響 在提取溫度為90 ℃、液料比為30∶1 mL/g的條件下,提取時間分別設定為1、1.5、2、2.5、3 h,考察不同提取時間對細辛多糖得率的影響。

1.2.2.3 液料比對細辛多糖得率的影響 在提取溫度為90 ℃、提取時間為2 h的條件下,液料比分別設定為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g,考察不同液料比對細辛多糖得率的影響。

1.2.3 Box-Behnken響應面法(BBD-RSM)優化多糖提取工藝 BBD-RSM評估基于單因素實驗的提取參數組合效應[28-30],參數變量包括提取溫度,提取時間和液料比,以多糖得率(%)作為響應值。該設計由17個具有五個中心點的組合組成,以計算該方法的可重復性,方差分析中F值和p值用于檢驗回歸系數的顯著性,通過對各項回歸系數進行回歸擬合,得到二次多項式回歸方程,并驗證多項式模型的準確性,實驗因素水平設置見表1。

表1 實驗因素水平及編碼

1.2.4 ASP-1的分級純化及抗氧化活性篩選 根據BBD-RSM獲得的最佳提取條件提取細辛多糖,將細辛多糖配制成5%的糖溶液,0.45 μm濾過后使用KTA explorer 100 層析系統分級純化多糖。DEAE-纖維素(3 cm×30 cm)用0→1 mol/L NaCl梯度洗脫,收集洗脫液,苯酚-硫酸法測定多糖含量,得到兩個主要多糖組分,分別為中性多糖ASP-1和酸性多糖ASP-2,透析后分別用Sepharose CL-6B(2.6 cm×100 cm)柱層析進一步純化,0.15 mol/L NaCl洗脫,得到分子量均一的細辛多糖組分,仍命名為ASP-1和ASP-2,透析后凍干[31-32]。苯酚-硫酸法測定多糖含量。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質含量。DPPH自由基(對1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基)清除實驗測定體外抗氧化活性,以維生素E(VE)作為陽性對照,步驟如下:分別取25、50、100、200、400、800 μg/mL的多糖溶液和維生素E 100 μL加入96孔板中,再加入2×10-4mol·L-1的DPPH溶液(無水乙醇配制)100 μL,混勻,避光室溫靜置30 min,在517 nm波長處測定吸光度,根據下式計算清除率:

式中:A3為不同濃度多糖加DPPH測得的吸光度,A2為不同濃度多糖加水測得的吸光度,A1為水加DPPH測得的吸光度值,A0為水測得的吸光度。

1.2.5 MTT細胞活力測定 用含有10%胎牛血清的H-DMEM培養液,將處于對數生長期的A10細胞(4000 cells/孔)接種于96孔板,置37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后,將ASP-1分別以25、50、100、200和400 μg/mL的終濃度預處理細胞,設置空白組(只加培養液,不加細胞和ASP-1)、對照組(加細胞和培養液,不加ASP-1)和Eto模型組(加細胞和培養液),每組設置5個復孔。37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后,在ASP-1預處理組和Eto模型組中加入Eto(終濃度為6 μmol/L)繼續培養24 h。隨后吸去上清液,每孔加入200 μL的H-DMEM培養液和20 μL的MTT溶液(終濃度為0.5 mg/mL)置培養箱中培養4 h。吸去上清液,每孔加入150 μL DMSO,搖床10 min,在490 nm處測定吸光度。根據下式計算細胞存活率:

式中:A實驗組為加藥處理組(ASP-1預處理組和Eto模型組)測得的吸光度,A對照組為不加藥物組測得的吸光度,A空白組為不加細胞和藥物組測得的吸光度。

1.2.6 衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色分析 MTT實驗確定200 μg/mL為ASP-1保護Eto誘導的A10細胞衰老的最佳劑量后,用含有10%胎牛血清的H-DMEM培養液,將處于對數生長期的A10細胞(30 000 cells/孔)接種到12孔板,置37 ℃、5%的CO2的培養箱中培養24 h,ASP-1(200 μg/mL)預處理細胞6 h,接著6 μmol/L Eto誘導48 h,正常培養48 h后,根據Beyotime生物技術研究所的說明,使用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒評估細胞衰老水平,倒置熒光顯微鏡下拍攝陽性細胞[33]。

1.3 統計分析

Design Expert軟件(版本8.0.6)用于響應面分析,GraphPad Prism 5軟件用于統計計算,實驗設計三個平行,數據表示為平均值±SD,ANOVA單因素方差分析用于組間比較,p<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溫度對細辛多糖得率的影響 提取溫度對多糖得率有明顯影響。如圖1,提取溫度由60 ℃升高到100 ℃時,多糖得率呈持續升高趨勢,從6.57%升高到9.31%。這與理論相符合,一定溫度范圍內,溫度升高使分子移動速率加快,多糖的溶出速率上升[34]。考慮到過高的溫度可能會影響多糖的穩定性,將響應面試驗中溫度變量設定為90～100 ℃。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響

2.1.2 提取時間對細辛多糖得率的影響 提取時間對多糖得率有明顯影響。如圖2,當提取時間從1 h增加到2 h時多糖得率呈升高趨勢,提取時間為2 h時,細辛多糖得率達到最大值9.61%,隨著提取時間的進一步增加,多糖得率明顯降低。這種現象與其它報道一致[35],一定時間范圍內,多糖得率隨著提取時間的加長而增加,然而,提取時間過長時,多糖得率呈下降趨勢,分析可能是多糖結構發生水解導致得率降低,將響應面試驗中時間變量設定為1.5～2.5 h。

圖2 提取時間對多糖得率的影響

2.1.3 液料比對細辛多糖得率的影響 不同溶劑與原料的比例(液料比)對多糖得率有明顯影響。如圖3,液料比10∶1 mL/g增加到30∶1 mL/g時,得率由5.48%升高到最大值9.33%,隨著液料比的進一步增加,多糖得率明顯降低。這是由于一定范圍內,液料比的增加有利于多糖浸出擴散到溶劑中,而液料比過高時,溶劑的增加會影響浸提體系的傳熱和傳質,不利于多糖的提取[36]。將響應面試驗中液料比變量設定為20∶1～40∶1 mL/g。

圖3 液料比對多糖得率的影響

2.2 BBD-RSM優化細辛多糖提取工藝

細辛多糖提取工藝的響應面試驗設計及結果如表2,ANOVA方差分析結果見表3。

表2 響應面優化試驗設計及結果

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

數據經回歸擬合后,得到回歸方程為:Y多糖得率(%)=8.58+0.58A+0.90B+0.45C-1.21AB-0.27AC+1.19BC+0.41A2-2.29B2。

選擇范圍內,提取溫度、提取時間、料液比對多糖得率均有顯著性影響(p<0.05)。各因素的F值大小依次為F(B)>F(A)>F(C),提取時間(B)對細辛多糖得率影響最大。各因素間交互作用對多糖得率亦有顯著性影響(p<0.05),其交互作用的等高線圖4和響應曲面圖5,證實了ANOVA方差分析結果。

圖4 2D等高線圖

圖5 三維響應曲面圖

本文通過繪制殘差與預測響應的關系,通過構建獨立變量(p<0.0001)的正態概率圖研究正態假設。如圖6所示,殘差正態概率分布圖接近一條直線,模型預測值與實際值近乎一條直線,模型預測值與殘差差異大,因此,本文得出的多項式模型是有效的,并且存在理想的最佳點。優化試驗得到的細辛多糖最佳提取條件為提取溫度90 ℃,提取時間2.37 h,液料比40∶1 mL/g,在此條件下,模型預測最大多糖得率為10.32%。為了進一步驗證該模型的可靠性,根據模型最佳提取條件進行3次平行驗證實驗,細辛多糖得率實際值為10.20%±0.22%,與理論預測值10.32%相近,相對誤差(1.18%)小于5%。因此,該模型能準確反映細辛多糖提取過程中各因素的交互作用,可用于優化細辛多糖的提取工藝。

圖6 殘差正態概率圖,預測值與實際值和殘差與預測值的比較

2.3 ASP-1的分級純化及活性篩選

如圖7A,細辛多糖經DEAE-纖維素陰離子交換柱分離得到兩個多糖組分,分別為中性多糖ASP-1和酸性多糖ASP-2,使用Sepharose CL-6B柱層析進一步純化,得到分子量均一的多糖組分,透析并凍干,仍命名為ASP-1和ASP-2。DPPH自由基清除實驗用于評價兩種多糖組分的抗氧化能力,結果如圖8,組分ASP-1抗氧化活性較強,ASP-1用于后續實驗的活性檢測。ASP-1理化性質分析見表4。ASP-1的總糖含量為96.9%,葡萄糖含量為58.35%,蛋白質含量為0.11%,糖含量較高。

圖7 DEAE-纖維素(A)和瓊脂糖CL-6B(B,C)對細辛多糖進行分級純化

圖8 ASP-1和ASP-2對DPPH自由基的清除能力

表4 ASP-1的理化性質

2.4 ASP-1對A10細胞衰老的保護作用

細胞衰老是指細胞生理功能的衰減,包括增殖能力下降,活力減弱。采用MTT法測定不同濃度ASP-1的細胞衰老保護功能,結果表明,ASP-1預處理對Eto誘導的A10細胞損傷具有保護作用,在25～200 μg/mL濃度范圍內,ASP-1對Eto誘導的A10細胞損傷有劑量依賴性保護作用,表現強的增殖活性,在濃度為200 μg/mL時,保護作用最強,400 μg/mL時保護作用下降(圖9),此現象是由于細辛多糖劑量過大產生毒性。

圖9 ASP-1對Eto誘導的A10細胞損傷的作用

衰老細胞形態結構上伴有體積增大,并且SA-β-gal表達水平增加,SA-β-gal是首個用于特異識別衰老細胞的分子標記物[37]。通過觀察細胞形態變化以及SA-β-gal染色評價ASP-1對Eto誘導細胞衰老的保護作用,如圖10所示,對照組細胞(Con)形狀小呈規則紡錘形,邊緣清晰。相反,Eto處理后,細胞形態增大變扁平,細胞數量明顯減少,符合衰老細胞的特征,相對于Eto模型組,200 μg/mL ASP-1處理組(ASP-1+Eto)細胞變小,衰老狀態減輕。衰老細胞數量的減少表明細胞衰老狀態的減輕,如圖11所示,藍染的細胞表示衰老細胞,對照組細胞(Con)無衰老陽性細胞,Eto模型組藍染細胞較多,表達高的SA-β-gal活性水平,200 μg/mLASP-1處理組(ASP-1+Eto)SA-β-gal藍染細胞明顯減少,表達低的SA-β-gal活性水平。SA-β-gal可能來源于溶酶體β-半乳糖苷酶,細胞發生衰老時溶酶體破裂在釋放水解酶的同時釋放SA-β-gal[38],Eto誘導細胞損傷使溶酶體生物合成增加,細辛多糖通過抑制溶酶體的生物合成起到衰老保護作用。

圖10 不同處理組細胞形態學觀察

圖11 ASP-1對Eto處理的A10細胞中SA-β-gal活性的影響

3 結論

本文通過響應面法優化細辛多糖提取工藝,提取溫度、提取時間和液料比三個因素及其交互作用對細辛多糖得率均有不同程度的影響,模型預測得到細辛多糖最佳提取條件為:提取溫度90 ℃,提取時間2.37 h,液料比40∶1 mL/g,多糖得率為10.20%。

血管平滑肌細胞的衰老與動脈粥樣硬化等血管疾病密切相關[39-40]。衰老細胞一方面表現為細胞增殖阻滯,MTT實驗證明Eto誘導A10細胞發生增殖阻滯,ASP-1處理組細胞顯示強的增殖活性,具有劑量依賴性保護作用;另一方面,衰老細胞的基因和蛋白表達譜發生改變[41]。衰老細胞通常體積變大,衰老β-半乳糖苷酶活性水平上調,通過形態學觀察及SA-β-gal染色結果表明:ASP-1可明顯抑制Eto誘導的A10細胞衰老形態變化,降低Eto誘導的SA-β-gal活性水平增加。綜上:ASP-1預處理對Eto誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞衰老具有保護作用,A10細胞衰老程度的降低有利于其保持正常的細胞功能和維持血管穩態,進而減輕血管疾病的發生發展。

Eto通過DNA損傷效應誘導細胞衰老,DNA損傷累積可能會導致端粒功能障礙,有文獻證明端粒重復序列結合因子2(TRF2)是血管平滑肌細胞衰老的主要調節因子[42]。因此,接著將從TRF2及衰老信號通路p53-p21、p16-pRb方向探討ASP-1發揮衰老保護作用的機制,并解析ASP-1的結構。深入研究細辛多糖對血管細胞衰老的作用機制,發掘中藥細辛對血管衰老的確切防治作用,將有利于細辛資源的綜合利用。