5種乳酸菌及其滅活態體外抗氧化能力的比較研究

陳漪汶,方若楠,朱劍鋒,龐 旭,徐 健,胡文鋒,*

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.生物源生物技術(深圳)股份有限公司,廣東深圳 518118;3.廣州無兩生物科技有限公司,廣東廣州 510640;4.廣州柏芳生物科技有限公司,廣東廣州 510640)

氧化應激是機體細胞內促氧化成分(如超氧化物、過氧化氫等)與抗氧化成分(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽等)之間平衡失調,體內氧自由基生成過多無法被清除,引起機體過度氧化,造成機體組織功能損害的一系列適應性的反應[1-2]。氧化應激及其介導的氧化損傷已成為機體不同系統疾病、老化發生與發展的一個基礎病理代謝過程[3-4],研究表明,隨著年齡的不斷增大,氧化應激會逐漸增加。已有報道益生菌食品可抑制氧化應激,如氧化應激在糖尿病的發病機制和進展中起主要作用,益生菌酸奶的攝入改善了2型糖尿病患者的空腹血糖含量及抗氧化狀態。而人類的衰老及一些疾病都與自由基的產生密切相關。機體衰老的自由基理論稱,衰老是機體自由基不斷積累的過程,自由基會使機體受到氧化損傷[5]。健康機體內,自由基會不斷被清除,達到自由基產生和清除的平衡[6],因此,有效地清除體內的自由基,能一定程度上延緩衰老。

近年來,研究發現,某些乳酸菌菌株具有抗氧化[7-9]、抗衰老[10]、抗癌[11-14]等重要生物學功能,日本的 Kuda等[14]從aji-narezushi和kaburazushi中分離出的植物乳桿菌,加入到日本白蘿卜汁和牛奶后,發現其可有效清除氧自由基。Marazza等[15]為了增強大豆飲料的生物活性,在豆漿發酵的過程加入鼠李糖乳桿菌CRL981作為β為葡糖苷酶的生產者,結果表明,加了鼠李糖乳桿菌發酵的豆漿較未發酵豆漿表現出較高的抗氧化活性(71.4%±4.0%)。Kullisaar等[16]研究發現,添加了發酵乳桿菌ME-3的山羊奶,具有抗動脈粥樣硬化的作用。益生菌的免疫調節已經成為食品微生物學的熱門話題,Liu等[17]試驗發現,副干酪乳桿菌和植入乳桿菌產生的胞外多糖有潛在的抗氧化特性,可刺激細胞增殖,對巨噬細胞有輕度免疫調節的作用。Bernini等[18]試驗發現,乳雙歧桿菌HN019對健康和代謝綜合征個體的炎癥和氧化應激均有益,在健康個體中還有抗氧化作用。許多研究報道集中對單一菌株的抗氧化能力探究,而對復配菌株的抗氧化能力的研究未見文獻報道,人進食多種乳酸菌后的抗氧化能力是否增強,在食品加工以及使用中有十分重要的參考價值。

本研究將對菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)、鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)5株乳酸菌滅活前后的發酵上清液(Cell free supernatant,CFS)、完整細胞懸液(Intact cells,IC)、胞內提取物(Cell-free extract,CFE)的抗氧化能力做系統的比較研究,并篩選出3株乳酸菌進行復配效果探究,單菌實驗結果表明,完整細胞懸液(Intact cells,IC)、發酵上清液(Cell free supernatant,CFS)這兩種活性成分的抗氧化能力效果最佳,因此復配時只研究這兩種活性成分,此研究為乳酸菌功能性食品、微生態制劑、天然抗氧化劑的開發和生產,提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鄰二氮菲、抗壞血酸、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、三氯乙酸、鄰苯三酚、過氧化氫、氯化鐵、Tris-HCl 均為國產，分析純;總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力測定試劑盒 南京建成科技有限公司;MRS 培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles) 均由華南農業大學食品學院應用型微生物實驗室保藏。

Centrifuge 5804R冷凍高速離心機 美國Eppendorf公司;PB-10型pH計 德國Sartorius公司;Evolution300型紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾公司;VCX 800型細胞破碎儀 美國SONICS公司;超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;SX-500型全自動高壓滅菌鍋 日本TOMY公司;生化培養箱 上海博迅實業有限公司;數顯恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的培養 乳酸菌菌株于37 ℃在MRS培養基斜面上活化培養24 h,再以1%的接種量接種于MRS液體培養基,37 ℃靜止培養12 h。

1.2.2 樣品的制備

1.2.2.1 乳酸菌完整細胞菌懸液的制備 取培養12 h的發酵液,10000 r/min離心15 min,收集菌體,并用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌后于10000 r/min離心15 min,以洗去培養基,重復3次。再將菌體重懸于PBS緩沖液,分別調整5株乳酸菌的菌數為109CFU/mL(OD600=1.1)完整細胞菌懸液。

1.2.2.2 乳酸菌發酵上清液的制備 取培養12 h的發酵液,收集發酵液,用雙蒸水將乳酸菌的菌數調整到109cells/mL,在10000 r/min轉速下離心15 min,收集上清液,經0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾,即為發酵上清液。

1.2.2.3 乳酸菌胞內提取物的制備 取培養12 h的發酵液,發酵液于10000 r/min的轉速下離心15 min,收集菌體,并用磷酸緩沖液(pH7.4)洗滌3次后,用無菌水調整乳酸菌為109cells/mL的菌懸液,在冰浴中超聲破碎細胞(工作功率300 W、工作時間2 s、間隔3 s、工作次數900次),破碎液于4 ℃、10000 r/min離心20 min,收集上清,即為胞內提取物。

1.2.2.4 滅活乳酸菌完整細胞菌懸液的制備 取培養12 h的發酵液,于100 ℃水浴30 min,即得乳酸菌滅活發酵液。10000 r/min離心15 min,收集菌體,并用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌后于10000 r/min離心15 min,以洗去培養基,重復3次。之后將菌體重懸于PBS緩沖液,調整乳酸菌的菌數調整到109CFU/mL,即為滅活完整細胞菌懸液。

同理可得滅活乳酸菌的發酵上清液、滅活乳酸菌的胞內提取物。

1.2.2.5 復合菌完整細胞的制備 選取抗氧化能力較強的菊糖芽孢乳桿菌、嗜酸乳桿菌和唾液乳桿菌菌株進行復配,將菌數為109CFU/mL的完整細胞分別按兩兩復配(1∶1)、三種菌復配(1∶1∶1)的比例充分混合,制備成復合菌完整細胞。

1.2.2.6 復合菌發酵上清液的制備 選取抗氧化能力較強的菊糖芽孢乳桿菌、嗜酸乳桿菌和唾液乳桿菌菌株進行復配,將其經0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾后的發酵上清液分別按兩兩復配(1∶1)、三種菌復配(1∶1∶1)的比例充分混合,制備成復合菌發酵上清液。

1.2.3 乳酸菌抗氧化活性的測定 單一乳酸菌菌株發酵上清液、胞內提取物、完整細胞菌懸液的提取物于-20 ℃保存備用,對單一菌株三種提取物分別進行總抗氧化活性、清除羥自由基、超氧陰離子自由基清除率、總超氧化物歧化酶活力、還原活性實驗。通過以上單菌實驗,篩選出3種抗氧化能力較強的菌株進行兩兩復配、三種菌復配試驗,以發酵上清液、完整細胞菌懸液為測定樣品。

1.2.3.1 清除羥自由基實驗 在1 mL 2.5 mmol/L鄰二氮菲中加入磷酸鹽緩沖液(PBS濃度為0.02 mol/L,pH=7.4)1 mL,樣品1 mL,充分反應后,加入硫酸亞鐵(FeSO4濃度為2.5 mmol/L)1 mL,搖勻,加過氧化氫(H2O2,質量分數為20 mmol/L)1 mL,37 ℃水浴1.5 h后在536 nm下測定其吸光度為As;用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2,1 mL蒸餾水代替1 mL樣品為Ab;用1 mL蒸餾水代替1 mL樣品為A0[19-20]。

羥自由基清除活性(%)=(As-A0)/(Ab-A0)×A基

1.2.3.2 超氧陰離子自由基清除率 于4.5 mL pH為8.0的Tris-HCl緩沖液加入0.1 mL樣品,25 ℃水浴20 min后,加入0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚,25 ℃水浴反應5 min后立刻加入2滴8 mol/L的HCl停止反應,在325 nm測吸光度即為A,用蒸餾水調零。空白組用0.1 mL H2O代替樣品即為A0[21]。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(A0-A)/(A0×A)×100

1.2.3.4 總抗氧化活性 在37 ℃時,每分鐘每毫升樣品,使反應體系的吸光度(OD)值,每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位(單位/毫升),用T-AOC測定試劑盒,按產品說明操作。

1.2.3.5 總超氧化物歧化酶活力 每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。用T-SOD測定試劑盒,按產品說明操作。

1.2.3.6 還原性 取0.5 mL乳酸菌的細胞生理鹽水懸浮液,加入到0.5 PBS溶液(0.2 mol/L,pH6.6)中,并加入0.5(1%,m/v)鐵氰化鉀溶液,此混合液放置于50化鉀溫度下水浴保溫20 min,于冰水中迅速冷卻至室溫,再向此混合液中加入1 mL的三氯乙酸(TCA,10%),充分混勻后,在4000 r/min轉速下離心處理10 min去除蛋白等沉淀物質,取1 mL上清液,向其中加入1 mL生理鹽水,同時加入1 mL FeCl3(0.1%,m/v),充分振蕩使其混合均勻,靜置孵育10 min后在波長700 nm下測定反應體系的吸光值。吸光度越大,待測樣品的還原能力越強[22]。

1.3 數據處理

試驗數據以3次重復的平均值標準誤差表示,數據處理采用Graphpad Prism 7.0軟件進行,差異顯著性分析和相關性分析采用SPSS 17.0軟件進行,顯著水平p設為0.05,當p≤0.05時,表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單種乳酸菌抗氧化能力的對比

2.1.1 總抗氧化活性 由圖1可知,從圖1可以看出,5種乳酸菌的不同提取物均呈現不同的總抗氧化活性,說明這5種乳酸菌的胞內產物、發酵產物以及完整細胞菌懸液均具有一定的總抗氧化能力,在5株乳酸菌滅活、未滅活的發酵上清液、完整細胞懸液、胞內提取物三種液體中,發酵上清液的總抗氧化活性最好,胞內提取物次之,完整細胞菌懸液較弱。5個菌種間的總抗氧化活性無顯著差異(p>0.05),同種菌的不同乳酸菌組分的總抗氧化活性差異顯著(p<0.05),嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的發酵上清液的總抗氧化活性最好。滅活后的乳酸菌不同提取物的總抗氧化活性較未滅活沒有顯著差異(p>0.05),滅活后的完整細胞菌懸液總抗氧化活性較未滅活有不同程度的提高。

圖1 五種乳酸菌總抗氧化活性

2.1.2 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力 由圖2可知,五種乳酸菌發酵上清液、完整細胞菌懸液和胞內提取物均表現一定的SOD活性,發酵上清液、胞內提取物以及完整細胞菌懸液的SOD活性因不同菌株差異不是很明顯(p>0.05),表明乳酸菌的SOD在胞內和胞外均有分布。不同的乳酸菌組分SOD差異顯著(p<0.05),完整細胞菌懸液的SOD活力最好,胞內提取物的SOD活力最差,初步得出SOD為附著在細胞表面的胞外酶的結論。其中嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)的滅活完整細胞菌懸液的SOD活性最強。滅活前后乳酸菌各組分的SOD活性沒有顯著差異(p>0.05),經滅活的發酵上清液和胞內提取物的SOD活力較未滅活有不同程度的提高,可能原因是滅活溫度不足以使相關酶失活,有關因子在高溫中被激活導致酶活性增加。

圖2 五種乳酸菌總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力

2.1.3 羥自由基(·OH)清除率 從圖3可知,嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)完整細胞菌懸液的羥自由基清除率最強為79.26657%。試驗菌株的完整細胞菌懸液的羥自由基清除率都強于乳酸菌其他組分,胞內提取物的羥自由基清除率能力較發酵上清液而言。結果表明,乳酸菌清除機體的羥自由基的活性物質主要存在菌體表面以及代謝產物中而非胞內。5種乳酸菌的羥自由基清除能力沒有顯著差異作用(p>0.05),乳酸菌的各種組分差異不顯著(p>0.05),滅活后的發酵上清液、完整細胞菌懸液的較未滅活的羥自由基清除能力沒有顯著差異作用(p>0.05),但滅活后的胞內提取物的羥自由基清除率有顯著差異(p<0.05),較未滅活的弱。

圖3 五種乳酸菌羥自由基率

2.1.4 超氧陰離子清除率 由圖4可知,5種乳酸菌的不同提取物均呈現一定的超氧陰離子自由基清除能力,說明乳酸菌的胞內和胞外產物以及完整細胞本身都可作為抗氧化劑去清除機體的超氧陰離子自由基。不同菌種的超氧陰離子自由基清除能力沒有顯著差異作用(p>0.05),提取物的不同也沒有顯著差異作用(p>0.05),滅活前后的乳酸菌清除超氧陰離子自由基也沒有顯著差異作用(p>0.05)。菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)的各種提取物的超氧陰離子自由基清除率均較高,其發酵上清液的超氧陰離子自由基清除率最強。經滅活后的乳酸菌提取物的超氧陰離子清除率較滅活前有變化,但總體區別不大。

圖4 五種乳酸菌超氧陰離子自由基清除率

2.1.5 還原性 由圖5可知,五種乳酸菌的不同提取物均具有一定的還原活性,完整細胞菌懸液及胞內提取物的還原活性較發酵上清液要低很多。不同菌株的還原活性沒有顯著差異作用(p>0.05),乳酸菌的不同組分存在較大差異(p<0.05),發酵上清液的還原活性差異顯著,其中唾液乳桿菌(LactobacillusSalivarius)的滅活發酵上清液的還原活性最大。乳酸菌滅活前后的還原活性沒有顯著差異作用(p>0.05)。

圖5 五種乳酸菌的還原活性

2.1 復合乳酸菌的抗氧化能力

2.2.1 總抗氧化活性 從圖6可知,滅活后的完整細胞菌懸液復合物較滅活前有明顯差異大幅的提升。乳酸菌完整細胞菌懸液的復合狀態對總抗氧化活性無顯著差異(p>0.05)。未滅活的完整細胞菌懸液復合物總抗氧化活性與單種乳酸菌完整細胞菌懸液活性相當。與單種滅活乳酸菌相比,滅活唾液乳桿菌(InactivedLactobacillusSalivarius)與滅活嗜酸乳桿菌(InactivedLactobacillusacidophilus)的完整細胞菌懸液的復合物的總抗氧化能力最好。單菌發酵上清液總抗氧化活性較復合發酵上清液強,滅活后的發酵上清液復合物較滅活前也無明顯變化。不同乳酸菌發酵上清液復合狀態對總抗氧化活性無顯著差異(p>0.05),總體上看發酵上清液復合物對抗氧化活性無影響。

圖6 乳酸菌復合物的總抗氧化活性

2.2.2 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力 從圖7可知,完整細胞菌懸液復合物SOD活力較單種乳酸菌完整細胞菌懸液小,滅活后的完整細胞復合物較滅活前的SOD活力略微下降。方差分析結果表明,乳酸菌完整細胞菌懸液復合狀態對SOD活力無顯著影響(p>0.05)。可能的原因為乳酸菌完整細胞的抗氧化物質具有與其他乳酸菌抗氧化物質協同或拮抗的作用。滅活后的發酵上清液復合物較滅活前的SOD活力小幅度提高。方差分析結果表明,乳酸菌發酵上清液復合物對總SOD活力無顯著影響(p>0.05)。復合后的發酵上清液較單種乳酸菌發酵上清液SOD活力無明顯變化。

圖7 乳酸菌復合物的SOD活力

2.2.3 羥自由基清除 從圖8可以看出,未滅活的完整細胞菌懸液復合物羥自由基清除率與單酸菌完整細胞菌懸液活性相當。滅活后的完整細胞復合物較滅活前的羥自由基清除率變大。其中,菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)與嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)復配的滅活前后完整細胞復合物的羥自由基清除率最高,滅活完整細胞懸液的羥自由基清除率(OH-·)最強,為82.40%;方差分析結果表明,乳酸菌完整細胞復合狀態對羥自由基清除率無顯著影響(p>0.05)。可能是因為乳酸菌完整細胞清除羥自由基的抗氧化物質無與其他物質協同或拮抗的作用。滅活后的發酵上清液復合物較滅活前的羥自由基清除率小幅提高。方差分析結果表明,乳酸菌發酵上清液復合狀態對羥自由基清除率無顯著影響(p>0.05)。其中,唾液乳桿菌與嗜酸乳桿菌發酵上清液復合物較單個乳酸菌的羥自由基清除率有較大提高。

圖8 乳酸菌復合物的羥自由基清除率

2.2.4 超氧陰離子清除率 從圖9可以看出,乳酸菌完整細胞菌懸液復合物較單種乳酸菌有小幅提高,滅活后的完整細胞復合物較滅活前的超氧陰離子清除率變大。方差分析結果表明,乳酸菌完整細胞菌懸液復合狀態對超氧陰離子清除率無很明顯的作用(p>0.05)。滅活后的發酵上清液復合物較滅活前的超氧陰離子清除率無明顯變化。乳酸菌發酵上清液復合狀態對超氧陰離子清除率無顯著影響(p>0.05)。

圖9 乳酸菌復合物的超氧陰離子清除率

2.2.5 還原性 從圖10可以看出,乳酸菌完整細胞菌懸液復合物較單種乳酸菌有小幅提高,滅活后的完整細胞復合物較滅活前的還原活性變大。方差分析結果表明,乳酸菌完整細胞菌懸液復合狀態對還原活性無很明顯的作用(p>0.05)。滅活后的發酵上清液復合物較滅活前的還原活性無明顯變化,乳酸菌發酵上清液復合狀態在還原活性上無顯著影響(p>0.05)。

圖10 乳酸菌復合物的還原性

3 結論