方格星蟲酶解液Maillard反應條件優化及理化特性變化

牛改改,游 剛,*,王 培,宋秋漫,蘇海媚,莫維維,梁櫻蓮

(1.北部灣大學食品工程學院,廣西欽州 535011;2.廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室,北部灣大學,廣西欽州 535011)

方格星蟲(Sipunculusnudus),俗稱“沙蟲”,又叫海人參,在我國沿海區域分布廣泛,其中以廣西北部灣海域分布量最為豐富[1-2]。方格星蟲味道鮮美,風味獨特,且具有較高的食用與藥用價值[3-4],廣受消費者喜愛。目前方格星蟲加工產品主要為凍制品與干制品,而相關的一些罐頭制品、調味料等加工品比較少見。美拉德(Maillard)反應又稱“非酶棕色化反應”,是一種羰氨縮合的非酶褐變反應,廣泛應用于食品的加工過程[5]。Maillard反應會產生許多香氣化合物與呈色物質[6],從而賦予產品特殊的色澤與風味,已廣泛應用于蝦副產物[7]、鮑魚蒸煮液[8]、貽貝煮汁[9]、牡蠣酶解液[10]、魚蛋白[11]等水產品水解液風味的改善,而關于方格星蟲酶解液Maillard反應工藝優化的研究未見報道。

本實驗以方格星蟲酶解液(Sipunculusnudusenzymatic hydrolysate,SEH)為原料進行Maillard反應,以褐變度和感官評分為評價指標,在單因素實驗的基礎上,通過正交試驗優化Maillard反應工藝條件,得到方格星蟲酶解液美拉德反應產物(Maillard reaction products ofsipunculusnudusenzymatic hydrolysate,MRPs-SEH);另對SEH與MRPs-SEH的色澤參數、游離氨基酸與總氨基酸含量、熒光強度進行對比分析,研究SEH Maillard反應前后理化特性的變化,為方格星蟲調味料的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮方格星蟲(體長(10±1.6) cm,體寬(1±0.3) cm,體質量(9±1.8) g) 采自欽州市茅尾海海域;胰蛋白酶(4000 U/g) 南寧東恒華道生物科技有限責任公司;D-半乳糖 食品級，浙江一諾生物科技有限公司;無水葡萄糖 食品級，天津市科密歐化學試劑有限公司;麥芽糖 食品級，上海潤捷化學試劑有限公司;α-乳糖 食品級，西隴化工股份有限公司;蔗糖 食品級，天津市華東試劑廠;鹽酸、三氯乙酸等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

分光測色計CM-3600d 日本柯尼卡·美能達公司;L-8900 氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司;DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠;DB-4不銹鋼電熱板 常州國華電器有限公司;840-210800紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;H1850臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;ST5000 pH計 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SEH的制備 參考文獻[10],并稍作修改。將新鮮方格星蟲去除內臟,清洗后瀝干,以1∶5 (w/v)的比例加水后,用組織搗碎機在10000 r/min下進行破碎打漿10 min,按底物質量加入8%(w/w)的胰蛋白酶,調整pH7.5,53 ℃酶解2 h后于90 ℃滅酶10 min,酶解產物9000 r/min離心20 min,所得上清液即為SEH。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 糖種類的選澤 取一定體積的SEH,分別添加3%(w/v)的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖和蔗糖,攪拌使其溶解,調節體系的pH為8.0,于120 ℃熱反應60 min后冷卻,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復三次,結果取平均值。

1.2.2.2 糖添加量的影響 取一定體積的SEH,分別添加1%、2%、3%、4%和5%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,調節體系的pH為8.0,于120 ℃熱反應60 min后冷卻,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復三次,結果取平均值。

1.2.2.3 pH的影響 取一定體積的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,分別調節體系的pH為6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,于120 ℃熱反應60 min后冷卻,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復三次,結果取平均值。

1.2.2.4 反應溫度的影響 取一定體積的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,調節體系的pH為8.0,分別于100、110、120、130和140 ℃下熱反應60 min。冷卻后,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復三次,結果取平均值。

1.2.2.5 反應時間的影響 取一定體積的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,調節體系的pH為8.0,于120 ℃溫度下分別反應30、45、60、75、90 min。冷卻后,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復三次,結果取平均值。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗基礎上,以感官評分為評價指標,以糖添加量、pH、反應溫度和反應時間四個因素進行四因素三水平L9(34)的正交優化試驗,各因素水平設計如表1所示。

表1 正交試驗的因素水平表

1.2.4 感官評定 通過感官評定對MRPs-SEH進行風味評價。請經過培訓且具有感官評定經驗的10名(5男5女)食品專業本科生組成感官評價小組,進行感官評定。參照文獻[9-10]制定感官評價標準,見表2。

表2 感官評價標準

1.2.5 褐變度的測定 將MRPs-SEH稀釋10倍,在420 nm處測定吸光值,以其表示Maillard反應的褐變程度[12]。

1.2.6 反應前后色澤的測定 參考Huang等[13]的方法。分光測色計開機預熱30 min后,分別用標準黑板和標準白板進行校準,取5 mL樣品溶液于玻璃皿中,測定SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應條件下制備)顏色參數L*(亮度)、a*(紅綠值)、b*(黃藍值)、C*(色度)和ΔE*(總色差)的變化,其中C*=(a*2+b*2)1/2,ΔE*=(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2;采用去離子水作為參比對照。

1.2.7 反應前后總氨基酸和游離氨基酸含量的測定 總氨基酸(Total amino acid,TAA)含量的測定參考Liu等[14-15]的方法,并稍作修改。分別取1 mL SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應條件下制備)于水解管中,加入8 mL HCl(6 mol/L)于110 ℃水解22 h后冷卻至室溫。將消解液定容至50 mL后,取1 mL于50 mL燒杯中,60 ℃水浴趕酸完全后定容至10 mL,過0.22 μm膜后采用自動氨基酸分析儀測定。Maillard反應前后TAA含量的變化率X1計算方法如下:X1=(MRPs-SEH中TAA含量-SEH中TAA含量)/(SEH中TAA含量)。

游離氨基酸(Free amino acid,FAA)含量的測定參考Liu等[14-15]的方法,并稍作修改。分別取10 mL SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應條件下制備)于100 mL燒杯中,加入10 mL 10%的三氯乙酸沉淀2 h,8000 r/min離心15 min后取2 mL上清液,過0.22 μm膜,采用自動氨基酸分析儀測定。Maillard反應前后FAA含量的變化率X2計算方法如下:X2=(MRPs-SEH中FAA含量-SEH中FAA含量)/(SEH中FAA含量)。

1.2.8 反應前后內源性熒光發射光譜掃描 參考Huang等[13]的方法。采用熒光分光光度計掃描SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應條件下制備)內源性熒光強度的變化。掃描參數設定為:激發波長298 nm,發射光譜掃描范圍309～450 nm,狹縫寬度5 nm,掃描溫度25 ℃。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 糖種類的選擇

糖的種類是影響Maillard反應強度的關鍵性因素[16]。由圖1可知,蔗糖、麥芽糖和乳糖反應體系的褐變程度與感官評分均小于葡萄糖體系和半乳糖體系,說明雙糖與SEH發生Maillard反應的活性較弱,產生的焦糖風味成分較少,這與Benjakul等[17]的研究結果Maillard反應速度己醛糖>二糖一致。半乳糖與SEH反應體系的褐變度和感官評分均顯著大于葡萄糖反應體系(p<0.05),馬振龍等[18]的研究結果顯示豬骨蛋白水解物-半乳糖反應體系的褐變程度大于葡萄糖體系,與本研究結果一致;牛改改等[19]發現半乳糖-牡蠣蛋白肽Maillard反應產物的功能特性與抗氧化性均顯著大于葡萄糖體系,說明半乳糖較葡萄糖具有更強的Maillard反應活性,支持了本研究結果。故后續實驗選用半乳糖作為Maillard反應的糖基供體。

圖1 糖種類對Maillard反應褐變度與感官評分的影響

2.2 糖添加量的影響

Maillard反應程度會隨著還原糖添加量的增加而增加[20]。糖添加量對MRPs-SEH褐變度與感官評分的影響如圖2所示。隨著半乳糖添加量的增加,MRPs-SEH的褐變度與感官評分不斷增加,說明Maillard反應程度在持續加深,褐色物質不斷生成。當糖添加量達到3%后,褐變程度趨于平緩,相對穩定,并在4%時達到最大。感官評分在糖添加量4%時達到最大值,隨后呈下降趨勢;這是由于增大半乳糖添加量加快了Maillard反應速度,豐富了揮發性物質種類,增強了MRPs-SEH的整體風味[21],但糖添加量過大時,會發生焦糖化反應,使反應體系色澤加深的同時產生焦苦味,感官評分下降[22]。因此,半乳糖的適宜添加量為4%。

圖2 糖添加量對Maillard反應褐變度與感官評分的影響

2.3 pH的影響

圖3 pH對Maillard反應褐變度與感官評分的影響

2.4 反應溫度的影響

由圖4可知,隨著反應溫度的升高,褐變程度逐漸加深,表明高溫可促進Maillard反應。相關文獻研究結果[15,25]表明，在一定反應時間內,溫度越高,Maillard反應速度越快,每升高10 ℃,反應速度增加3～5倍。MRPs-SEH的感官評分隨著溫度的升高先增加后減小,在130 ℃時達到最大值,這是由于反應溫度過高時,產物會發生碳化,產生較強烈的焦糊味,因此,適宜的反應溫度為130 ℃。

圖4 反應溫度對Maillard反應褐變度與感官評分的影響

2.5 反應時間的影響

從圖5可以看出,隨著反應時間的延長,褐變度先快速上升后趨于平緩,這主要是因為在反應初期褐色物質生成相對較少,吸光值較低,隨反應進行,褐色產物累積,Maillard反應逐漸趨向完全[26]。反應時間在30～60 min時,MRPs-SEH風味隨著反應的充分進行而濃郁,當反應時間超過60 min時,焦糊味和硫味越來越濃,掩蓋了方格星蟲原有的鮮味,感官評分下降,這可能與過量生成的類黑精色素被環化產生一系列吡嗪、吡啶等含氮雜環化合物有關[27]。故反應時間選擇60 min。

圖5 反應時間對Maillard反應褐變度與感官評分的影響

2.6 正交試驗

感官評價可直接反映Maillard反應對SEH風味的改善情況,而褐變度反映的是Maillard反應的程度,褐變度過大時,MRPs-SEH風味反而會變差,故正交試驗以感官評價為指標,優化Maillard反應條件,結果見表3。從表3可知影響感官評分結果的因素主次順序為D(反應時間)>C(反應溫度)>B(pH)>A(糖添加量),最優組合是A2B2C2D2,即4%的半乳糖添加量、pH9.0、130 ℃的反應溫度和60 min的反應時間。由于正交實驗中沒有A2B2C2D2組合,故在該條件下進行3次驗證實驗,感官評定結果為(13.77±0.47)分,高于正交實驗的任一組,說明該組合為MRPs-SEH風味改善的最佳條件。

表3 正交試驗設計與結果

2.7 反應前后色澤參數的變化

SEH與MRPs-SEH的顏色參數如表4所示,由表4可知,Maillard反應前后顏色差異顯著(p<0.05)。MRPs-SEH較小的L*與較大的ΔE*說明Maillard反應使酶解液亮度變暗,顏色加深。a*、b*和C*增大,表明MRPs-SEH顏色更加偏紅與偏黃,色澤更加飽滿;這是因為Maillard反應的終產物褐色素類黑精使體系顏色加深。Jonathan等[28]的研究結果表明,Maillard反應產物L*減小,a*與b*增大,顏色加深,與本研究結果一致。

表4 Maillard反應前后顏色參數的變化

2.8 反應前后游離氨基酸和總氨基酸含量變化

在Maillard反應過程中,一方面,FAA或肽中的氨基與糖分子結構中的羰基共價連接形成糖蛋白,另一方面,大分子肽分解成氨基酸和小分子肽,說明在反應進程中FAA含量變化是一個動態過程[15,29],因此Maillard反應的程度需由TAA含量表示。Maillard反應前后TAA含量變化如表5所示。由表5可知,Maillard反應產物中TAA含量較SEH顯著降低(p<0.05),其中SEH中TAA含量為703.987 mg/g,MRPs-SEH中TAA含量較SEH降低60.27%,這是由于Maillard反應消耗的氨基酸大于肽分解生成的氨基酸,且Strecker降解、熱分解、以及糖和氨基酸或肽結合形成Maillard產物使得TAA含量降低,與Liu等[14]的研究結果一致。Tyr與Met含量較SEH分別減少73.84%、72.98%,說明這兩種氨基酸參與Maillard反應的程度較大,而His(含量降低44.85%)參與Maillard反應的活性相對較低。

表5 Maillard反應前后總氨基酸含量變化

Maillard反應前后FAA含量變化結果見表6。由表6可知,MRPs-SEH中FAA組成與SEH相同,除色氨酸被酸處理破壞未檢出外,均檢測出17種常見的氨基酸。各氨基酸含量和TFAA含量均有不同程度減少,MRPs-SEH中TFAA含量為124.682 mg/g,較SEH降低51.12%。MRPs-SEH中的苦味氨基酸Val、Leu、Ile、Met、Phe、Ser、Arg、His與鮮味氨基酸Asp、Glu、Gly、Ala含量較SEH均降低,而TUAA/TFAA與TBAA/TFAA則大于SEH,其中TUAA/TFAA較SEH增加了8.26%,大于TBAA/TFAA的增加率(1.90%),表明Maillard反應減少了SEH中的苦味,同時使鮮味氨基酸在總游離氨基酸中的比例增加。

表6 Maillard反應前后游離氨基酸含量變化

2.9 反應前后內源性熒光強度變化

Maillard反應前后酶解肽結構的變化可由內源性熒光強度變化來評價[30]。圖6顯示了SEH和MRPs-SEH的內源性熒光光譜圖。當激發波長在298 nm時,SEH的最大熒光強度峰位于368 nm。SEH與半乳糖發生Maillard反應后,產物的熒光強度明顯降低,熒光吸收峰幾乎消失,這與SEH和半乳糖發生Maillard反應形成了屏蔽效應有關[13,31]。Huang等[13]和Corzo-Martínez等[31]分別發現卵清蛋白和β-乳球蛋白與還原糖發生Maillard反應降低了產物的熒光強度,引起蛋白質圍繞色氨酸殘基構象的變化;Corzo-Martínez等[31]進一步比較了不同溫度(40、50 ℃)下Maillard反應產物最大熒光發射波長變化,發現40 ℃條件下還原糖影響β-乳球蛋白側鏈結構,僅引起β-乳球蛋白三級結構變化而沒有破壞原有結構,在50 ℃條件下β-乳球蛋白結構受還原糖影響較大,但未能確定是幾級結構變化。本研究結果發現Maillard反應降低了產物熒光強度,引起SEH中多肽的結構變化,但尚不能確定是幾級結構發生變化,后續實驗將進一步利用圓二色譜和熒光光譜法探討其結構變化。

圖6 Maillard反應前后內源性熒光光譜變化

3 結論

方格星蟲酶解液Maillard反應的最佳工藝條件為:半乳糖添加量4%、pH9.0、反應溫度130 ℃和反應時間60 min,在該條件下感官評定達到13.77分。與SEH相比,MRPs-SEH的L*減小,a*、b*、C*和ΔE*均增大,Maillard反應使得酶解液亮度變暗,色澤加深且更加飽滿。MRPs-SEH中的17種氨基酸含量較SEH均顯著降低(p<0.05),其中Tyr和Met參與Maillard反應的程度較大,分別減少73.84%、72.98%,而His(含量減少44.85%)參與Maillard反應活性相對較低;另外,MRPs-SEH中鮮味氨基酸在總游離氨基酸中的比例較SEH增加8.26%。Maillard反應引起SEH肽鏈結構變化。后續實驗將進一步采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用定性定量分析SEH與MRPs-SEH的揮發性風味成分變化,分析并找出主要風味貢獻成分,為研發新型方格星蟲調味品提供理論參考。

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