高產洛伐他汀紅曲菌的篩選及菌種共酵對紅曲固態發酵的影響

朱 蕊,彭 林,劉雙平,2,韓 笑,2,毛 健,2,*

(1.江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122;2.江蘇省產業技術研究院食品生物技術研究所,如皋江大食品生物技術研究所有限公司,江南大學(如皋)食品生物技術研究所,江蘇如皋 226500)

紅曲菌是一種具有我國傳統特色的絲狀真菌,經固態發酵得到的產物為紅曲[1]。紅曲作為中國傳統的藥食兼用天然制品,廣泛應用于食品、醫藥、保健品等行業[2],多將紫色紅曲菌用于生產[3]。紅曲菌發酵能夠產生多種對人體有益的代謝產物[4-8],其中洛伐他汀具有很強的降膽固醇、降血脂的保健作用[9]。

目前我國洛伐他汀的生產主要來源于紅曲菌發酵,紅曲的固態發酵相比于液態發酵節省了發酵后期的分離純化工作,更安全且容易吸收,可以直接通過食用達到治療目的[10-11]。紅曲的發展方向多集中于紅曲菌菌種選育、優化培養參數提高紅曲中洛伐他汀的含量,降低生產成本[1,12-13]。近年來有學者研究發現添加一些外源誘導物可以促進洛伐他汀的合成[14-16],Sun等[17]發現通過添加真菌誘導劑-擲孢酵母濾液可以提高液態發酵的洛伐他汀產量,當酵母濾液在第4 d加入時,最高產量可達446.92 mg/L。研究表明[18],因為培養條件相似,紅曲菌與酵母菌、乳酸菌或其他真菌誘導子通過共酵的培養方式能使次級代謝產物的產量有所提高,這提示其他微生物代謝的某些酶或是產物可能對紅曲菌生長及洛伐他汀的積累有促進作用。

因此本文在市售紅曲中篩選出高產洛伐他汀紫色紅曲菌的基礎上,利用特性較優的紫色紅曲菌株固態發酵生產紅曲,采用不同菌種與其共酵的方式進一步優化其洛伐他汀產量,篩選出共酵優秀菌株,并初步探究其誘導機理,為深度開發藥食兼用的功能性紅曲提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲樣品 從福建寧德、浙江溫州、廣東麗水等地采集市售紅曲樣品10份;秈米 市售;克魯斯假絲酵母Y6、釀酒酵母SY、枯草芽孢桿菌4-LCW、植物乳桿菌X5、米曲霉P7、黃酒酵母S2-1392、釀酒酵母2.2084、畢赤酵母S12、熱帶假絲酵母CS8、貝酵母S.bay 均為本實驗室篩選保藏菌株,來源如表1所示;馬鈴薯葡萄糖水培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽汁瓊脂(MEA)、察氏培養基(CYA) 廣東環愷威生物科技有限公司;洛伐他汀(純度≥98%) Sigma公司。

表1 不同菌種及其來源

YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;PRX-450C型智能人工氣候箱 寧波賽福實驗儀器有限公司;SW-CJ系列超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;UV-1800型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;Waters e2695高效液相色譜系統(配有2489紫外檢測器及Empower 2色譜工作站) 美國沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲篩選分離源指標檢測 選取來自福建、廣東、浙江等不同來源的10份市售紅曲米作為篩菌的分離源,初步評價市售紅曲,與后續實驗中純種制曲比較,利用高效液相色譜法測定市售紅曲中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測定其色價,實驗重復3次取平均值。

1.2.2 產洛伐他汀紅曲菌的篩選及鑒定

1.2.2.1 紅曲菌的篩選 稱取5 g紅曲樣品,在無菌研缽中研磨成粉末后置于95 mL帶玻璃珠的無菌生理鹽水的三角瓶中,在搖床上振蕩30 min后進行梯度稀釋。吸取0.1 mL涂布于PDA平板上,28 ℃培養3～4 d,用無菌接種環挑取單個菌落轉接至新的PDA平板,經過反復分離純化,得到具有紅曲菌基本特征的較純菌株,鑒定完畢后甘油管保藏至-80 ℃。

1.2.2.2 菌落形態觀察 參考《紅曲菌的形態與分類學》[19],采用三點接種法將菌株分別點種于MEA、PDA和CYA培養基上,25 ℃培養7 d,觀察菌落的形態特征,包括菌落的正反面顏色、質地、邊緣等。

1.2.2.3 分子生物學鑒定 以提取的紅曲菌總DNA[20]為模板,利用真菌ITS通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,PCR擴增的反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環;72 ℃延伸10 min。所得產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序所得的序列信息利用BLAST程序在GenBank核酸數據庫中進行相似性比對,利用MEGA6.0軟件對所測紅曲菌與序列同源性高的模式菌株的基因序列進行多序列比對分析,利用Neighbor-Joining鄰接法構建系統進化樹。

1.2.3 菌種培養 紅曲菌菌株活化:用無菌接種環刮取保藏管里的菌種劃線于麥芽汁斜面上。28 ℃培養5～7 d,培養至紅曲菌長出孢子。

固態發酵:用0.1%無菌吐溫水洗下斜面上的孢子,30 g秈米浸泡2 h后轉入250 mL錐形瓶,封口后于121 ℃,0.08 MPa滅菌20 min后,趁熱將米粒拍散,接種106個孢子/g(大米干重)接種于冷卻至室溫的固態發酵培養基,補加無菌水調節含水量在40%～50%;拌勻后使培養基堆至瓶內一角,28 ℃靜置培養48 h后搖散、攤平;此后每24 h搖瓶1～2次,直到14 d發酵結束。利用高效液相色譜法測定紅曲固態發酵產物中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測定其色價,實驗重復3次取平均值。

1.2.4 菌種共酵

1.2.4.1 紅曲菌共酵菌種活化 分別選取1.1中列舉的實驗室保藏菌株于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中進行活化,28 ℃活化24 h至培養基渾濁。

1.2.4.2 紅曲菌與不同菌種共發酵 按照1.2.3中固態發酵法制備紅曲,同時將活化后的菌種菌液以2%接種量接入固態發酵培養基與紅曲菌進行共酵實驗,以紅曲菌H8-2純種發酵作為對照組。利用高效液相色譜法測定紅曲固態發酵產物中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測定其色價,實驗重復3次取平均值。

1.2.5 添加不同酵母誘導劑的研究 根據1.2.4的實驗結果,選擇釀酒酵母2.2084為共酵菌株,以此制備不同酵母誘導劑。酵母菌液:將釀酒酵母28 ℃搖瓶培養24 h取樣;酵母發酵液:將上述釀酒酵母搖瓶24 h后的菌液,4 ℃條件下8000 r/min離心所得上清液;高溫滅菌液:酵母培養24 h后,100 ℃高溫滅菌20 min;酵母破壁液:將釀酒酵母28 ℃搖瓶培養24 h后,4 ℃條件下8000 r/min離心后用無菌水洗滌菌體,重復兩次,將酵母菌體置于含有石英砂的滅菌研缽中研磨10 min,吸取至2 mL離心管中4 ℃條件下8000 r/min離心,所得上清液為酵母破壁液。按照1.2.3中固態發酵法制備紅曲,同時將酵母誘導劑以2%接種量接入固態發酵培養基與紅曲菌進行共酵實驗,以紅曲菌H8-2純種發酵作為對照組。利用高效液相色譜法測定紅曲固態發酵產物中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測定其色價,實驗重復3次取平均值。

1.2.6 洛伐他汀的檢測 參考文獻[21]檢測方法,在實驗室條件下進一步優化,采用HPLC法,稱取紅曲粉0.5 g置于50 mL離心管中,加入甲醇30 mL,50 ℃振蕩水浴2 h,搖勻,常溫條件下8000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜。

色譜條件:色譜柱:Athena C18-WP(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%的磷酸水溶液(65∶35,V/V);流速:1.0 mL/min;紫外檢測波長:238 nm;進樣量:5 μL;柱溫:(30.0±0.5) ℃。以70%乙醇溶液配制400 mg/L的洛伐他汀標準儲備液,等比稀釋制得濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L的洛伐他汀標準工作液,進行外標定量。標曲線性方程為:y=3.64×104x-2.35×105,決定系數R2=0.9912。

1.2.7 色價的測定 采用紫外分光光度計法,參考國標GB 4926-2008《食品添加劑 紅曲米(粉)》。

1.3 數據分析

實驗操作重復三次,采用Excel進行數據計算,采用Graphpad Prism 7軟件進行分析繪圖。

2 結果與分析

2.1 高產洛伐他汀紅曲菌的篩選和鑒定

2.1.1 紅曲菌篩選分離源指標檢測 對取樣紅曲樣本進行初步評價,由表2可知,取樣的這些市售紅曲洛伐他汀含量較低,基本在1.8～3.5 mg/g之間,色價質量參差不齊,洛伐他汀產量和色價之間無必然聯系。

表2 紅曲分離源指標檢測結果

2.1.2 紅曲菌株篩選結果 紅曲菌是一種腐生菌,其生長適應的溫度范圍很廣,最適溫度為25～30 ℃,能利用多種碳源和氮源生長。相較于其他菌,紅曲菌生長比較緩慢,因此采用比較普適的PDA培養基平板,在28 ℃下培養5～6 d進行篩選。通過梯度稀釋及反復分離純化,從上述2.1.1的10份紅曲米中分離疑似霉菌菌株的純培養菌株21株。

根據進一步形態觀察,并以產紅色素的菌株為挑選標準,選取菌落呈現紅色并具有紅曲菌典型特征的菌株進一步篩選,共得到10株紅曲菌菌種,分別命名為H1-4、H4-2、H4-4、H6-2、H6-3、H7-2、H8-1、H8-2、H9-2、H10-1。

2.1.3 紅曲菌的固態發酵特性比較 為篩選得到高產洛伐他汀的紅曲菌,本研究對2.1.2中篩選得到的10株紅曲菌進行了固態發酵實驗,并檢測發酵后紅曲中洛伐他汀的含量和色價。如圖1菌株H8-2的洛伐他汀產量明顯高于其他菌株(圖1a),色價結果也較優(圖1b)。為進一步確定菌株H8-2的發酵穩定性,本研究利用菌株H8-2連續發酵三次后(表3),得到洛伐他汀產量基本穩定,均值達到9.79 mg/g(干重),色價可達1805.43 μ/g,發酵制備的紅曲質量遠高于2.1.1中菌種來源的市售紅曲。說明利用H8-2菌株純種制曲可得到高產洛伐他汀的紅曲,故確定菌株H8-2為后續實驗的供試菌株。

表3 菌株H8-2固態發酵情況

圖1 紅曲菌菌固態發酵洛伐他汀產量(a)和色價(b)比較

2.1.4 菌株H8-2的鑒定

2.1.4.1 形態觀察 將菌株H8-2分別點種于MEA、PDA和CYA培養基上,25 ℃培養7 d。在相同培養條件下這10株紅曲菌菌落形態差異很小,其典型菌株形態如圖2所示,紅曲菌在MEA平板上生長狀況最好,明顯優于PDA平板和CYA平板,在MEA平板上紅曲菌菌落呈絨氈狀,有淺色且短的氣生菌絲,背面呈現出放射狀輻射紋,菌絲體開始為白色,隨菌落成熟而變成橙紅色至深紅色,菌落略微隆起,邊緣不整齊。PDA平板上生長狀況次之,紅曲菌生長速度較慢,放射狀輻射波紋減少。CYA培養基上生長狀況最不理想,生長速度最慢,未見放射狀輻射波紋,菌落顏色也較淺,呈粉色。參考《真菌鑒定手冊》[22],并根據《紅曲菌的形態與分類學》[19]進行檢索,對紅曲菌進行初步觀察,鑒定菌株為紫色紅曲菌。

圖2 紅曲菌株H8-2在不同培養基上的菌落形態

2.1.4.2 分子生物學鑒定 菌株H8-2的rDNA-ITS PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖3所示,擴增產物長度在500～700 bp之間,條帶明亮單一,說明特異性擴增良好。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序后將得到的受試菌基因序列經校對和拼接后在NCBI上比對發現與紫色紅曲菌MonascuspurpureusJCM 6934的同源性達99%以上,構建系統進化樹(圖4)。結合形態學觀察,基本可以將此紅曲菌種鑒定為紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)。該菌種是在食品中使用最廣泛的紅曲固態發酵菌種。

圖3 紅曲菌株H8-2的rDNA-ITS PCR產物電泳圖

圖4 紅曲菌H8-2的ITS系統進化樹

2.2 不同菌株與紅曲菌共酵培養對洛伐他汀產量及色價的影響

在我國傳統發酵食品的生產中常采用多菌種混合體系進行發酵,發酵過程中菌種之間的相互作用對食品的風味和功能性物質的含量具有直接影響。因此在本研究中,將紅曲菌H8-2與食品中篩選得到的酵母、枯草芽孢桿菌、霉菌、乳酸菌進行共酵,發酵結束后檢測紅曲中洛伐他汀和色素含量。

由圖5a可知,相比較紅曲菌H8-2純種制曲的對照組,除枯草芽孢桿菌4-LCW外,其他菌種的共酵都使洛伐他汀的產量有不同程度的提高,其中酵母菌SY及米曲霉P7顯著提高了紅曲中的洛伐他汀含量,發酵結束后洛伐他汀含量分別達到12.37和12.10 mg/g。圖5b在檢測不同菌種共酵后紅曲的色素含量后發現,酵母SY共酵后色價達到2014.49 μ/g,是所有共酵菌種中紅曲色價含量最高的菌種。因此,綜合不同菌種共酵對紅曲洛伐他汀和色素含量的影響后,確定以酵母作為紅曲的共酵菌種進行進一步的優化。

圖5 不同菌種對紅曲洛伐他汀產量(a)和色價(b)的影響

2.3 不同種類酵母菌與紅曲菌共酵對洛伐他汀產量及色價的影響

基于2.2實驗結果,發現酵母菌更適合與紅曲菌共酵制曲,并對洛伐他汀產量有顯著影響。因此選擇實驗室保藏的不同種類的7株食品來源酵母菌,與紅曲菌H8-2共酵制曲,考察不同酵母對固態發酵紅曲質量的影響,并篩選出優良的共酵菌株。由圖6a可知,兩種釀酒酵母2.2084與SY對洛伐他汀產量有顯著性提高,其中釀酒酵母2.2084使洛伐他汀產量極顯著提高(p<0.0001),達12.93 mg/g,產量相比H8-2純種制曲的對照組提高了34.5%。圖6b共酵對紅曲色價的影響,發現釀酒酵母2.2084也能使色價有小幅提高,但不同酵母與紅曲菌共酵對紅曲色價的影響都不顯著(p>0.05),說明共酵可能對紅曲色價的影響不大。因此綜合考慮選擇釀酒酵母2.2084為與紅曲菌H8-2共同發酵制曲的優良共酵菌株,擬用此菌株進行后續研究。

圖6 不同酵母菌種對紅曲中洛伐他汀產量和色價的影響

2.4 不同酵母誘導劑對紅曲固態發酵中洛伐他汀及色價的影響

為初步探究共酵使洛伐他汀產量提升的機理,選擇2.3中最優共酵菌種釀酒酵母2.2084制備不同誘導劑,分別添加釀酒酵母菌液、酵母發酵液、高溫滅菌液和酵母破壁液到紅曲菌固態發酵培養基中與紅曲菌H8-2進行共酵,經過14 d的固態發酵后,發現不同酵母誘導劑都對洛伐他汀的產量有較明顯的提高,如圖7a所示,其中酵母菌液的提高作用最為顯著(p<0.001)。推測活的酵母菌液對固態發酵產洛伐他汀更為有益,可能由于酵母在固態發酵過程中與紅曲菌共酵,持續生長,從而釋放更多對洛伐他汀產量提高有益的誘導因子,使產量顯著提高。而高溫滅菌液、酵母破壁液也能使紅曲固態發酵中洛伐他汀的產量顯著提高(p<0.01),產量分別為11.96和12.24 mg/g,分別比H8-2純種制曲的對照組提高了24.8%和27.8%。由圖7b觀察酵母誘導劑對紅曲色價的影響,發現4種酵母誘導劑均能使色價有所提高,對色價有較好影響,因此酵母對色價無不良影響。趙樹欣等[23]在紅曲菌液態發酵中也做過類似研究,發現在紅曲菌發酵初始添加酵母破壁液2.7%(v/v),洛伐他汀的產量可達61.93 mg/L。分析可能因為固態發酵與液態發酵的狀態對共發酵制曲的影響不同。因此酵母共酵提高紅曲菌洛伐他汀含量的關鍵物質存在于胞內,且關鍵物質在熱處理后仍保持洛伐他汀促進作用,表明關鍵物質對熱不敏感。對于酵母中關鍵物質的進一步確認和探索其誘導機制,仍需要要進一步研究。

圖7 不同酵母誘導劑對紅曲洛伐他汀產量和色價的影響

3 結論

本實驗從市售紅曲中篩選得到一株高產洛伐他汀的紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)H8-2,并通過與食品來源菌株共酵的方式進一步優化紅曲制曲方法。研究表明,紅曲菌與釀酒酵母共酵使洛伐他汀產量由未共酵的9.79 mg/g提高到12.93 mg/g,洛伐他汀含量提高了34.5%,對色價無不良影響,可得到質量較高的功能性紅曲。相比市售紅曲中洛伐他汀產量在1.8～3.5 mg/g范圍內,本研究篩選的菌株純種制曲產洛伐他汀含量遠高于市售紅曲,并成功建立一種共酵提高紅曲洛伐他汀的方法。在對釀酒酵母共酵提高紅曲洛伐他汀含量的機理進行初步探究后,發現促進紅曲霉產洛伐他汀的關鍵物質可能存在于酵母胞內,且熱處理對關鍵物質的促進沒有負面影響,此結果為后續進一步探索關鍵物質的種類及其促進機制提供了研究基礎。