氮摻雜碳點的開關型熒光傳感器檢測蔬菜中的生物硫醇

何 諧,雒雪麗,李春花,韓 雍,陳秀梅,李忠宏

(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

蔬菜中的生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、γ-谷氨酰半胱氨酸(GGC)和卡托普利(CAP)等小分子物質在生理系統中起著重要的作用[1]。它們既可以作為抗氧化劑[2]保護細胞免受可能導致癌癥和阿爾茨海默病的氧化損傷[3],也可以作為解毒劑和金屬離子發生反應。其中,半胱氨酸在側鏈上具有巰基,在酶促反應中起到親核試劑的作用,還可以有效地預防和治療放射性傷害[4]。還原型谷胱甘肽在細胞的生長、信號傳導、基因調節和維持細胞正常功能的氧化還原平衡上起著關鍵作用[5]。如果將蔬菜或水果暴露在以消毒為目的的輻照和臭氧處理中,其所含有的硫醇可能會發生氧化且導致有毒副產品的產生。因此檢測生物和環境樣品中的小分子生物硫醇引起科學家們極大的興趣[6]。

常見檢測生物硫醇的方法包括電化學法[7]、比色法[8]、色譜-質譜聯用/質譜法(LC-MS/MS)[9]、分光光度法[10]和高效液相色譜法[11]等。這些方法具有靈敏度高和檢測限低等優點,但是電化學法、比色法、分光光度法對樣品的需求量較大、檢測用時較長,HPLC具有操作復雜、費時、所需儀器昂貴等缺點。熒光檢測法作為一種既省時又綠色環保的測定方法,受到眾多分析測試人員的青睞。

近幾年來,熒光探針在生物硫醇檢測和應用方面取得了有效進展[12]。目前,檢測生物硫醇的熒光傳感器主要包括有機染料、分子熒光和傳統半導體量子點(QDs)。其中,有機染料容易光漂白,而QDs往往含有重金屬元素,因此限制了它們的廣泛使用。碳點(CDs)不僅具有與傳統量子點類似的發光性能和納米尺寸特性,還具較毒性較低、制備成本低廉、熒光穩定性和化學穩定性等優點[13],因此利用CDs作為信號源來開發光學納米傳感器成為研究熱點。目前,許多基于CDs的傳感平臺是猝滅型熒光傳感器[14]。熒光可以被分析物直接淬滅,根據CDs熒光強度的改變來檢測分析物。然而這種檢測模型易受環境刺激的影響導致方法的分析性能降低。而開關型熒光傳感器模型是根據加入分析物后恢復的熒光進行檢測,可以減少外界刺激造成的假陽性,因而具有更好的靈敏度[15]。

盡管研究人員已設計合成了許多識別硫醇的熒光探針,但是對于檢測食品基質中生物硫醇的熒光探針未見報道。因此,本文以檸檬酸和尿素為原材料制備氮摻雜碳點(N-CDs),利用Hg2+對CDs熒光有良好的猝滅作用[16],而巰基和汞離子的親和力更強,故生物硫醇可以將Hg2+從CDs表面競爭下來,從而使得CDs熒光恢復。基于以上原理,本文開發了一種熒光傳感器選擇性地檢測蔬菜中的生物硫醇,對檢測體系的pH、Hg2+濃度和孵化時間(熒光淬滅和恢復)進行優化,并對探針的抗干擾性能以及準確度進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一水合檸檬酸、六水合三氯化鐵、氯化鉀、氯化鋅、氯化鈉 廣東光華科技股份有限公司;HgCl2山東西亞化學工業有限公司;尿素、氯化錳、氯化鎂、冰乙酸 成都市科龍化工試劑廠;抗壞血酸 廣東化工攝影工程技術研究開發中心;甘氨酸 北京Solabio科技有限公司;谷胱甘肽、苯丙氨酸、硫酸奎寧、賴氨酸、色氨酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋(截留分子量1 Da) 北京索萊寶公司;無水氯化鈣 廣東光華化學廠有限公司;三水合乙酸鈉 四川西隴化工有限公司;所有試劑均為分析純,未進一步純化。

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司;HC-3018R高速冷凍離心機 北京儀諾科興科技發展有限公司;DGG-9030B電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信儀器公司;Perkin-Elmer LS-55熒光分光光度計 美國鉑金埃爾默公司;JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM) 日本JEOL公司;FE20/EL20 pH計 梅特勒-托利多儀器公司;KH-250E超聲清洗器 昆山禾創超聲儀器公司;Vetex70傅里葉變換近紅外光譜(FT-IR) 德國布魯克公司;CP-224C分析天平 奧豪斯儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 N-CDs的制備 N-CDs通過水熱法[17]并加以改進合成。具體步驟如下:將4.2 g檸檬酸和3.6 g尿素溶解于40 mL蒸餾水中,250 W超聲10 min形成透明溶液,將該溶液轉移至50 mL聚四氟乙烯內襯反應釜中,在200 ℃下保持4 h。待反應釜自然冷卻至室溫后,將所得溶液用0.22 μm的水系濾膜過濾后,避光儲存于25 ℃下。

1.2.2 N-CDs的表征

1.2.2.1 形貌表征 采用透射電鏡觀察N-CDs的形貌和微觀結構。

1.2.2.2 光學表征 采用熒光光譜法對制備得到的N-CDs進行發光性能表征。采用紫外光譜掃描法在200～800 nm波長范圍內,對N-CDs的紫外吸收進行表征。

1.2.2.3 表面基團 利用FT-IR對N-CDs的表面基團進行表征。

1.2.2.4 量子產率的測定 以硫酸奎寧為參比物質,采用斜率比較法[18]計算N-CDs的量子產率。將硫酸奎寧溶于0.1 mol/L H2SO4中,其量子產率(QY)是54%。用紫外分光光度計測量所有溶液在360 nm處的吸光度值A(為了最小化重吸收保證測量準確,吸光度值小于0.1)。用熒光光譜儀測量所有溶液在360 nm激發波長下的熒光光譜,并記錄所得熒光光譜在370～700 nm范圍內的積分面積值,此值為積分熒光強度通過記錄同一物質一系列濃度的積分熒光強度和吸光度值,以吸光度值為橫坐標,積分熒光強為縱坐標在Oringin 8.0中作圖,為系列點添加截距為0的線性擬合直線,得到直線的斜率。N-CDs的QY按照公式(1)計算:

Qx=Qst(Gradx/Gradst)(ηx/ηst)2

式(1)

其中,Q為量子產率,Grad為所擬合直線的斜率,η為溶劑的折射率。下標st為硫酸奎寧,x為N-CDs。在本體系中,由于硫酸奎寧溶解在稀硫酸中,N-CDs溶解在去離子水中,所以ηx/ηst≈1。

1.2.3 探針的制備與優化 采用單因素實驗探討檢測體系pH、Hg2+濃度、孵育時間等因素對熒光猝滅效率、熒光恢復效率和熒光強度的影響,在優化條件下構建生物硫醇檢測方法。所有試驗重復3次。

1.2.3.1 pH設定 N-CDs濃度為1 mmol/L,醋酸鹽緩沖液pH為3.6、4.0、4.6、5.0、5.6,向N-CDs溶液中加入濃度為400 μmol/L的Hg2+以猝滅熒光,室溫反應10 min后在選定的熒光測試條件下掃描熒光光譜。同時,在相應體系中加入1 mmol/L 生物硫醇標準液以恢復熒光,室溫反應10 min后掃描熒光光譜。根據所得熒光光譜,對數據進行處理。根據熒光猝滅效率(Effq,式2)和熒光恢復效率(Effr,式3)確定最佳pH。

Effq(%)=(F0-F)/F0

式(2)

Effr(%)=(Fr-F)/(F0-F)

式(3)

其中,F和F0表示在加入和不加入Hg2+的情況下N-CDs在432 nm處的熒光強度;Fr為加入生物硫醇到N-CDs/Hg2+傳感體系后N-CDs在432 nm處的恢復熒光強度。

1.2.3.2 Hg2+濃度設定 N-CDs濃度為1 mmol/L,pH為優化值,向N-CDs溶液中滴加不同濃度的Hg2+儲備液(100、200、300、400、500 μmol/L),反應10 min后評估Hg2+濃度對N-CDs的熒光猝滅作用。同時,在相應體系中加入1 mmol/L生物硫醇標準液以恢復熒光,室溫反應10 min后掃描熒光光譜。根據所得熒光光譜,對數據進行處理。確定最佳Hg2+濃度。

1.2.3.3 孵育時間設定 熒光猝滅模式下孵育時間的優化:設定N-CDs濃度為1 mmol/L,pH和Hg2+濃度為優化值,在相應體系中加入Hg2+溶液,將熒光掃描模式切換成Time Drive(時間步長0.01 s,掃描時間30 min),得到加入Hg2+后熒光強度隨時間變化的曲線確定最佳猝滅孵育時間。

熒光恢復模式下孵育時間的優化:設定N-CDs濃度為1 mmol/L,pH和Hg2+濃度為優化值,加入Hg2+溶液后室溫孵育10 min。在相應體系中加入1 mmol/L生物硫醇標準液,在Time Drive熒光掃描模式下得到加入生物硫醇后熒光強度隨時間變化的曲線確定最佳孵育時間。

1.2.4 標準曲線的建立 在優化條件下,將100 μL N-CDs溶液(1 mmol/L)和1 mmol/L的氯化汞溶液依次加入醋酸鹽緩沖液(pH為檢測生物硫醇的優化值,0.01 mol/L),并在室溫下孵育10 min后加入不同濃度的生物硫醇標準液(0、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600 μmol/L),室溫振蕩孵育10 min后,掃描熒光光譜。數據擬合得到熒光恢復因子F/F0(F0和F是分別在不存在和存在生物硫醇的情況下N-CDs/Hg2+傳感體系在432 nm處的熒光強度)隨濃度C變化曲線及決定系數R2、線性范圍及LOD(式4)。

LOD=3δ/k

式(4)

式中:δ為空白信號的標準偏差(n=3);k為標準曲線斜率。

1.2.5 干擾實驗 傳感器的選擇性對于實際蔬菜樣品中生物硫醇的檢測至關重要,實際蔬菜含有礦物離子、有機酸和氨基酸。因此,采用可能共存的干擾物質(苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、抗壞血酸、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Na+和K+)來評價該方法的選擇性。分別將100 μL N-CDs溶液(1 mmol/L)和1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Na+、K+和Hg2+溶液加入醋酸鹽緩沖液(pH為檢測生物硫醇的優化值,0.01 mol/L),并在室溫下孵育10 min后用熒光強度響應[(F/F0)-1]評估干擾物對N-CDs的熒光猝滅作用。另外,將100 μL N-CDs溶液(1 mmol/L)和1 mmol/L的Hg2+溶液加入醋酸鹽緩沖液(pH為檢測生物硫醇的優化值,0.01 mol/L),室溫下孵育10 min后再分別加入1 mmol/L的苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、抗壞血酸、GSH和Cys,室溫下孵育10 min后用熒光強度響應[(F/F0)-1]評估干擾物對N-CDs/Hg2+的熒光恢復作用。

1.2.6 加標回收試驗 依據文獻[6]的方法處理荷蘭豆和螺絲辣椒:荷蘭豆和螺絲辣椒各取三個樣品進行分析,將荷蘭豆去皮洗凈與螺絲辣椒洗凈的果肉切塊混合,分別從荷蘭豆和螺絲辣椒的切片中取4.5 g置于醋酸鹽緩沖液(分別放置于pH=5.0和pH=5.6)中,共4個分析樣品,將樣品用研缽研碎(研磨時間為15～20 min),并以10000×g離心15 min,然后取出1 mL上清液,用構建的探針檢測處理后的分析物溶液。每個樣品重復三次。

1.3 數據處理

使用2010版Excel和Nanomeasure軟件對數據進行統計分析,使用Origin 8.0軟件繪制圖。使用Minitab 16.2.3軟件分析數據,數據均表示為平均值,通過單因素方差分析評估所有數據的差異,當方差分析中的p值表明統計學意義時,通過Tukey檢驗評估差異,p<0.05的值被認為是統計學上顯著的。本文所有實驗均做三次平行(除優化孵育時間外)。

2 結果與分析

2.1 N-CDs的表征結果

從N-CDs的TEM圖(圖1)可以看出,所制備的N-CDs為準球形。

圖1 N-CDs的TEM圖

通過使用Nanomeasure軟件對大約100個N-CDs納米顆粒進行統計分析,從圖2可知N-CDs的粒徑分布范圍為0.88～7.94 nm,平均直徑為4.53 nm。

圖2 N-CDs的粒徑分布圖

N-CDs的紫外吸收光譜和熒光光譜如圖3所示,331 nm處的紫外吸收峰屬于N-CDs表面C=O或C-OH的n-π*躍遷引起的。熒光光譜表明,N-CDs的最佳激發和發射峰分別是340和432 nm。該N-CDs的Stokes’位移為92 nm,這一較大的Stokes’位移可以有效避免激發和發射光譜之間的重疊而有利于后期的分析檢測應用。從圖3的插圖可以看出,所制備的N-CDs在水中分散性良好,在365 nm的紫外燈管照射下發出強烈的藍光。

圖3 N-CDs的紫外吸收光譜(1)、激發光譜(2)和發射光譜(3)

從N-CDs的紅外光譜(圖4)可以看出波數在3229、3360和3444 cm-1的峰屬于-OH的伸縮振動,寬的羥基吸收帶表明N-CDs表面上存在多個羥基結構,賦予CDs更高的極性和親水性[19]。2985、2980和3040 cm-1的峰屬于C-H的伸縮振動,1580、1490和1400 cm-1處的吸收峰表明N-CDs表面存在C=O/N-H、-COOH,1054 cm-1處的吸收峰屬于C-O。FTIR結果顯示-OH的伸縮振動發生移動,可能是Hg2+和N-CDs的-OH發生了絡合作用導致N-CDs的熒光猝滅。

如圖5所示,激發波長為340 nm,以硫酸奎寧為參比,N-CDs的QY為32.72%。摻雜后CDs的QY明顯高于僅僅以檸檬酸為唯一碳源制備的CDs的QY。以上表征說明合成的N-CDs具有較高的極性、親水性、量子產率以及較大的Stokes’位移，有利于檢測蔬菜中的生物硫醇。

圖5 N-CDs的量子產率

2.2 生物硫醇檢測條件的優化

2.2.1 體系pH 生物硫醇在中性和堿性條件下穩定性差,其中半胱氨酸易被氧化為胱氨酸,谷胱甘肽易被氧化為氧化型谷胱甘肽,降低pH可使其穩定性增強,由于pH對生物硫醇和Hg2+有影響,因此需要對探針檢測生物硫醇的pH進行優化。相應的曲線如圖6所示。可以從圖6看出在pH從3.6增加到4.0和從4.6增加到5.0時,熒光淬滅效率(Effq,見式2)以較低的速度增強,當pH從4.0增加到4.6時,Effq又快速增加。最后,Effq在pH5.0～5.6內無顯著變化(p>0.05)。在pH3.6～4.6的范圍內,羧酸酯基團和胺基團被質子化,導致N-CDs帶負電。N-CDs表面羧基的質子化作用隨著pH的增加而逐漸被去質子化過程所取代,導致帶負電荷的羧基可吸引帶相反電荷的Hg2+。N-CDs表面的-NH3+在pH從4.6增加到5.0的過程中趨于逐漸去質子化,從而增強了N-CDs之間的靜電斥力,并增加了熒光強度。在pH5.0～5.6的范圍內,N-CDs的熒光強度無顯著變化(p>0.05),可能是由于-NH3+和-COOH去質子平衡。

圖6 N-CDs-Hg2+,N-CDs-Hg2++Cys/GSH在不同pH下對Effq和Effr的響應

當pH從3.6增加到4.0和從4.0增加到4.6時,GSH的熒光恢復效率(Effr,見式3)分別以較高的速度增強和降低,當pH從4.6增加到5.0和從5.0增加到5.6時,N-CDs-Hg2++GSH的Effr分別以較低的速度增強和降低。在pH為4.0、4.6和5.0時有較大的GSH的Effr,分別為104.1%、85.80%和84.80%。綜合考慮N-CDs-Hg2+的Effq和N-CDs-Hg2++GSH的Effr,因此選擇pH=5.0用于構建檢測GSH的探針。同檢測GSH,選擇pH=5.6用于構建檢測Cys的探針。

2.2.2 Hg2+終濃度 探討了Hg2+的濃度對熒光猝滅和恢復的影響,相應的曲線如圖7A和圖7B所示。可以從圖7A看出,在pH=5.0的條件下,檢測GSH的Effq在測試的Hg2+濃度范圍內逐漸升高,升高的速度逐漸降低,這表明Hg2+鍵合到N-CDs上的量逐漸增加接近飽和。在Hg2+濃度為200 μmol/L時,有最大檢測GSH的Effr為88.20%。在N-CDs/Hg2+傳感系統中,Hg2+濃度對于提高分析性能至關重要,當Hg2+濃度較低時,Effr對GSH測定的背景熒光值比較高,同時線性范圍窄;高濃度的Hg2+又使得低濃度GSH恢復熒光的能力有限,直接影響到測定的靈敏性。綜合考慮探針檢測的靈敏度和線性范圍及實驗安全性,因此選擇200 μmol/L Hg2+用于構建檢測GSH的探針。

另外,從圖7B可以看出,在pH=5.6的條件下,檢測Cys的Effq在測試的Hg2+濃度范圍內逐漸升高,升高的速度逐漸降低,這同樣說明Hg2+鍵合到N-CDs上的量逐漸增加接近飽和。當Hg2+的濃度低于200 μmol/L時,檢測Cys的Effr隨著Hg2+濃度的增加逐漸變小,當Hg2+的濃度在200～400 μmol/L時,檢測Cys的Effr隨著Hg2+濃度的增加逐漸增加,在Hg2+的濃度為300～400 μmol/L時,檢測Cys的Effr增加速度最低,當Hg2+濃度為400 μmol/L時有最大Effr為87.66%。當Hg2+的濃度繼續增加時,檢測Cys的Effr在400～500 μmol/L范圍內逐漸降低。同檢測GSH,綜合考慮探針檢測的靈敏度和線性范圍及實驗安全性,因此選擇300 μmol/L Hg2+用于構建檢測Cys的探針。

圖7 (A)Hg2+終濃度對檢測GSH的Effq和Effr的響應;(B)Hg2+終濃度對檢測Cys的Effq和Effr的響應

2.2.3 孵育時間 研究孵育時間(猝滅和恢復時間)以評估熒光傳感器對生物硫醇的響應時間,圖8A為在pH=5.0條件下N-CDs的熒光強度隨孵育時間(熒光猝滅/GSH恢復)變化的曲線。圖8B為在pH=5.6條件下N-CDs的熒光強度隨孵育時間(熒光猝滅/cys恢復)變化的曲線。從圖8A可以看出,N-CDs熒光強度在加入200 μmol/L Hg2+后在0～460 s時呈下降趨勢,隨著時間的增加,N-CDs熒光強度在460 s后達到平衡(p>0.05),這意味著N-CDs表面的官能團(例如-NH2、-OH和-COOH)可以快速與Hg2+相互作用而引起熒光猝滅并在460 s后達到飽和。向N-CDs/Hg2+體系中加入1 mmol/L GSH后,當反應時間超過380 s后,熒光強度基本保持不變(p>0.05),表明380 s足以使GSH恢復N-CDs的熒光。因此,當檢測GSH時,猝滅孵育時間為460 s,恢復的孵育時間為380 s。同檢測GSH,當檢測Cys時,猝滅孵育時間為440 s,恢復的孵育時間為400 s。因為儀器的噪音的影響,圖中存在幾個N-CDs熒光強度隨著時間的增加而增加的時間段。

圖8 (A)N-CDs的熒光強度隨孵育時間(熒光猝滅/GSH恢復)的變化;(B)N-CDs的熒光強度隨孵育時間(熒光猝滅/Cys恢復)的變化

2.3 標準曲線

在最優條件下,利用設計的可切換熒光“開-關-開”傳感器對生物硫醇進行檢測,N-CDs/Hg2+的熒光強度隨著生物硫醇濃度的增加逐漸恢復。熒光恢復因子F/F0(F0和F是分別在不存在和存在生物硫醇的情況下N-CDs/Hg2+傳感體系在432 nm處的熒光強度)同GSH濃度的曲線如圖9所示。GSH濃度在0～300 μmol/L范圍內,F/F0與GSH濃度之間具有良好的線性關系,決定系數(R2)為0.9948。線性方程表示為F/F0=0.00324[C]+0.9686,其中[C]是GSH的濃度,LOD為2.56 μmol/L。熒光恢復因子F/F0同Cys濃度的曲線如圖10所示。Cys濃度在100～400 μmol/L范圍內,F/F0與Cys濃度之間也具有良好的線性關系,決定系數(R2)為0.99207。線性方程表示為F/F0=0.00408C+0.61037,其中C是Cys的濃度,檢測限(LOD)為3.46 μmol/L。

圖9 不同GSH濃度下N-CDs/Hg2+傳感探針的熒光發射光譜圖

圖10 不同GSH濃度下N-CDs/Hg2+傳感探針的熒光發射光譜圖

2.4 干擾試驗

本文所開發的熒光傳感器的選擇性對于實際蔬菜樣品中生物硫醇含量的測定具有重要影響。由于實際蔬菜樣品中含有礦物離子,有機酸和氨基酸等，因此,采用可能共存的干擾(苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、抗壞血酸、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Na+和K+)來評價該方法的選擇性,并且熒光強度響應[(F/F0)-1]與干擾物種類關系的柱形圖如圖11所示。從圖11(A)可以看出,Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Na+和K+對N-CDs熒光強度的影響可忽略不計(熒光相應<5%),而Fe3+對N-CDs的熒光強度的影響較弱,只有Hg2+能夠較大程度地猝滅N-CDs的熒光強度,表明N-CDs對Hg2+具有高選擇性。從圖11(B)可以看出,苯丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、色氨酸和抗壞血酸對N-CDs/Hg2+熒光檢測生物硫醇的影響可忽略不計(熒光相應<5%),結果表明,構建的傳感器在存在干擾物時可用于蔬菜中生物硫醇的檢測。

圖11 N-CDs對Hg2+和干擾離子以及N-CDs/Hg2+對GSH和Cys以及干擾物的熒光強度響應

2.5 加標回收

將此傳感器用于荷蘭豆和螺絲辣椒中GSH和Cys的檢測。GSH和Cys分別做三種不同濃度的加標回收試驗,所有試驗做三次平行,結果如表1所示,樣品加標回收率都在80%～120%之間,證明此方法的準確度較好。

表1 加標回收試驗結果

3 結論

本研究構建的N-CDs/Hg2+探針具有較好的穩定性,基于這種探針設計了特異性檢測生物硫醇的方法。以檢測體系pH、Hg2+濃度、孵育時間(熒光猝滅和恢復時間)為單因素,優化得到GSH的最佳檢測條件為pH=5.0,Hg2+濃度為200 μmol/L,460 s熒光猝滅和380 s熒光恢復,最佳檢測Cys條件為pH為5.6,Hg2+濃度為300 μmol/L,440 s熒光猝滅和400 s熒光恢復,在最優條件下該傳感器對0～300 μmol/L的GSH和100～400 μmol/L的Cys具有線性響應,檢測限分別為2.56、3.46 μmol/L。該方法的空白加標回收率為80%～120%之間。干擾實驗表明蔬菜中可能存在的干擾物對傳感器沒有顯著影響,因此該傳感器用于檢測蔬菜中的生物硫醇具有可接受的選擇性。另外,該傳感器具有快速的熒光猝滅和恢復響應、較高的靈敏度和準確度,為食品基質中生物硫醇的熒光快速檢測提供一種新思路。