乳酸對卵清蛋白抑菌活性的增效作用

孫雅靜,陳 倩,顧麗紅,徐煥煥,張 璟,郭愛玲,2,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,湖北武漢 430070;2.國家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心,湖北武漢 430070)

卵清蛋白作為禽蛋蛋清中的主要蛋白質(zhì)(54%)[1],具有來源廣泛、制備容易、價格低廉等優(yōu)點,是開發(fā)新型天然生物抑菌劑的重要資源。長期以來,對卵清蛋白的研究多集中于結(jié)構(gòu)、抗氧化性、功能特性等方面[2-3],主要通過酶解或化學改性的方式來增強卵清蛋白的抑菌活性[4-6],這些方法在增強卵清蛋白抑菌活性的同時增大了制備成本,不利于卵清蛋白在抑菌領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此,開發(fā)一種能夠經(jīng)濟有效增強卵清蛋白抑菌活性的方法非常必要。

作為食品添加劑的乳酸或天然發(fā)酵產(chǎn)品中的乳酸被認為是一種安全的天然生物防腐劑[7]。乳酸便宜且環(huán)保,能夠抑制多種類型食物腐敗細菌的生長,包括腸桿菌科和假單胞菌科的革蘭氏陰性菌[8-13]。乳酸的抑菌分子機制主要包括降低pH、細胞膜透化、提高滲透壓、抑制大分子合成以及誘導抗菌肽產(chǎn)生等,其中乳酸進入細胞內(nèi)使細胞內(nèi)pH降低是乳酸主要的作用方式[14]。

但目前乳酸在食品中的使用濃度有一定限制,無法直接添加大量乳酸作為殺菌劑應(yīng)用,Alakomi[15]發(fā)現(xiàn),高濃度乳酸的抗菌作用在很大程度上(但不完全)歸因于其以未解離形式穿透細胞質(zhì)膜的能力,導致細胞內(nèi)pH的降低和跨膜質(zhì)子動力的破壞,而在低濃度如最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)或亞致死濃度下,可作為革蘭氏陰性細菌外膜的透化劑以及作為其他抗菌物質(zhì)的增效劑。龐文聰?shù)萚16]將二氫楊梅素與乳酸協(xié)同抑制副溶血弧菌,發(fā)現(xiàn)當添加1%的乳酸后,抑菌圈直徑由原來的10.7 mm增大至19.3 mm,表明乳酸明顯增強了二氫楊梅素對副溶血弧菌的抑菌活性。因此,采用低濃度的乳酸作為滲透劑,將食品級滲透劑與其他抗菌劑結(jié)合使用將是抑制食品材料中腐敗菌和病原菌的新思路。

本試驗通過乳酸處理大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌2種常見致病菌和燦爛類芽胞桿菌、土變形桿菌2種腐敗菌,研究了不同濃度、不同溫度和不同乳酸處理時間對卵清蛋白抑菌活性的影響,并研究了在最佳乳酸處理條件下,乳酸處理前、后對卵清蛋白抑菌活性的增加率及抑菌動力學曲線，以期為卵清蛋白這種禽蛋中的天然食品成分在抑菌領(lǐng)域的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichiacoli)O157∶H7 ATCC 51659 武漢市疾病預防控制中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 21600 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;燦爛類芽胞桿菌(Paenibacilluslautus)、土變形桿菌(Proteusterrae) 由本實驗室從雞蛋中分離得到;乳酸 國藥集團化學試劑有限公司;卵清蛋白 Biosharp公司;營養(yǎng)瓊脂(NA)、營養(yǎng)肉湯(LB)培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純。

SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;UV-1700型紫外可見分光光度計 Shimadzu;5415-R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;TECAN帝肯Infinite M200 Pro NanoQuant酶標儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;pH計 杭州聯(lián)測自動化檢測有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 從平板上挑取一個單菌落接種于LB肉湯中,37 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h,離心取菌體,經(jīng)無菌生理鹽水稀釋至菌濃度為107CFU/mL,以平板計數(shù)法測定其具體菌濃度。

1.2.2 乳酸及卵清蛋白溶液的制備 使用PBS(10 mmol/L,pH7.4)為溶劑分別配制10%的乳酸儲備溶液和25.6 mg/mL卵清蛋白儲備液,經(jīng)0.22、0.45 μm細菌過濾器過濾除菌,4 ℃冷藏保存。

1.2.3 乳酸和卵清蛋白最小抑菌濃度測定 采用微量肉湯稀釋法[17]測定抑菌劑的最小抑菌濃度(MIC),即先向96孔板的各孔加入100 μL無菌LB肉湯,再向每一排第一孔加入100 μL抑菌劑,用槍頭充分吹打混勻后吸取100 μL至第2孔,依次二倍系列稀釋至同一排的第11孔,第11孔混勻后吸取100 μL棄去。然后向每排的1～10孔和第12孔加入100 μL經(jīng)生理鹽水稀釋的菌液(約105CFU/mL),第11孔加入100 μL生理鹽水。將板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。以陰性對照孔(12孔)全部渾濁,陽性對照孔(11孔)全部清亮視為結(jié)果有效。使用酶標儀測定各孔的OD600,全抑制的孔所對應(yīng)的最小抑菌劑濃度即為該抑菌劑對該菌的MIC。

1.2.4 不同乳酸處理條件對抑菌活性的影響

1.2.4.1 乳酸處理濃度的影響 依據(jù)1.2.3實驗結(jié)果得到乳酸對各測試細菌的MIC值,對每種細菌選取了三個乳酸濃度(表1),考察亞致死劑量下(低于MIC值),不同濃度的乳酸處理對卵清蛋白抑菌活性的影響。

測試組1(不同濃度乳酸+卵清蛋白):將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液在4 ℃、3500 r/min離心10 min,收集沉淀,用棄去上清液等體積的不同濃度(表1)的乳酸重懸,室溫靜置處理30 min,在相同條件下再次離心,棄去上清液,沉淀用PBS(10 mmol/L,pH7.4)洗滌2次后重懸于PBS中。然后取100 μL該懸浮液到96孔板中,各孔中已含有100 μL 卵清蛋白溶液(用LB肉湯稀釋,濃度6.4 mg/mL)。

表1 處理不同細菌使用的乳酸濃度

測試組2(不同濃度乳酸):取100 μL用不同濃度(表1)乳酸處理后的菌懸液加入到含有100 μL空白肉湯(不含卵清蛋白)的孔中。

測試組3(卵清蛋白):取100 μL經(jīng)PBS處理過的菌液加入到含有100 μL卵清蛋白溶液的孔中。

對照組:取100 μL經(jīng)PBS處理過的菌液加入到含有100 μL空白肉湯(不含抑菌劑)的孔中,此組的OD600記為A0。

將板在桌上輕輕振蕩混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,使用酶標儀測定各孔的OD600,通過公式(1)[17]計算抑菌劑的抑菌活性,以測試組為橫坐標,其各自對應(yīng)的抑菌活性為縱坐標,確定乳酸處理濃度對卵清蛋白抑菌活性的影響。

式(1)

其中:U為抑菌活性,U;A0為對照組的吸光度;A為測試組的吸光度。

1.2.4.2 乳酸處理時間的影響 按照1.2.4.1所述操作進行乳酸處理,乳酸使用濃度:對燦爛類芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為0.05%、對大腸桿菌O157∶H7為0.20%、對土變形桿菌為0.15%,室溫靜置處理10、20、30、40、60、90和120 min后,后續(xù)操作同1.2.4.1節(jié)。

1.2.4.3 乳酸處理溫度的影響 實驗步驟同1.2.4.1所述,乳酸濃度同1.2.4.2,分別在4、25、30、37、40和50 ℃下靜置處理40 min。

1.2.5 最佳乳酸處理條件下對卵清蛋白抑菌活性的影響 按照表2乳酸對各測試菌的最佳處理條件對細菌進行乳酸處理,實驗步驟同1.2.4.1。乳酸處理前后卵清蛋白抑菌活性的增加率見式(2)。

表2 乳酸對各測試菌的最佳處理條件

增加率(%)=(處理后活性-處理前活性)×100/增效前活性

式(2)

1.2.6 乳酸處理前后卵清蛋白的抑菌動力實驗 將菌隔夜培養(yǎng)至對數(shù)期(16～18 h),離心,菌體經(jīng)乳酸處理后用PBS重懸,使最終菌濃度達107CFU/mL,取100 μL菌懸液于96孔板中,加入100 μL 不同濃度(6.4、1.6、0.4 mg/mL)的卵清蛋白溶液,混勻后,于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h,分別在 0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h測定各孔的OD600,以單獨使用乳酸和單獨使用卵清蛋白為試驗組對照,以沒有任何抑菌劑處理作為生長對照組。然后以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標,各時間點測得的OD600為縱坐標,繪制抑菌動力學曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述所有實驗均重復3次,用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(p=0.05),用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸和卵清蛋白的抑菌活性

通過微量肉湯稀釋法測定乳酸和卵清蛋白對測試菌株的最小抑菌濃度(MIC)如表3所示。

表3 乳酸和卵清蛋白對測試菌的最小抑菌濃度(MIC)

注：G+表示革蘭氏陽性菌，G-表示革蘭氏陰性菌。

乳酸對測試菌的MIC分別為燦爛類芽胞桿菌0.0781%、金黃色葡萄球菌0.1172%、土變形桿菌0.1563%、大腸桿菌O157∶H7 0.3125%,表明乳酸對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑菌活性,且對革蘭氏陽性菌的抑菌活性明顯強于革蘭氏陰性菌。

卵清蛋白對測試的2種革蘭氏陽性菌的MIC分別為0.4 mg/mL(燦爛類芽胞桿菌)和6.4 mg/mL(金黃色葡萄球菌),對于測試的革蘭氏陰性菌,在給定的最大卵清蛋白濃度作用下,其生長仍不能受到有效抑制,表明卵清蛋白主要可以抑制革蘭氏陽性菌,且對燦爛類芽胞桿菌的抑菌活性遠遠強于金黃色葡萄球菌,但其對于革蘭氏陰性菌抑菌活性不強(可能需要較高的濃度)。

2.2 乳酸預處理后卵清蛋白的抑菌活性

2.2.1 不同濃度乳酸處理后卵清蛋白的抑菌活性 從圖1中可以看出乳酸對卵清蛋白增效作用的強弱在不同測試菌株之間存在差異,不同細菌對乳酸的敏感性不同,乳酸的最佳作用濃度存在較大差異。由圖1可知，0.05%濃度的乳酸可以較好地增加卵清蛋白對燦爛類芽胞桿菌(圖1A)和金黃色葡萄球菌(圖1B)的抑菌活性;對于土變形桿菌(圖1C),宜選擇0.15%的乳酸濃度;對于大腸桿菌O157∶H7(圖1D),0.2%濃度的乳酸可以最大幅度地增強卵清蛋白的抑菌活性。經(jīng)乳酸處理后,卵清蛋白對兩種革蘭氏陰性菌抑菌活性的增大幅度明顯大于對兩種革蘭氏陽性菌。表明乳酸更加顯著地增加了卵清蛋白對革蘭氏陰性菌的抑菌活性(p<0.05)。

圖1 乳酸處理濃度對卵清蛋白抑菌活性的影響

2.2.2 乳酸處理不同時間后卵清蛋白的抑菌活性 由圖2可以看出,燦爛類芽胞桿菌、土變形桿菌和大腸桿菌O157∶H7,乳酸處理10 min即可增強卵清蛋白的抑菌活性(表現(xiàn)為10 min處的抑菌活性高于0 min),處理40 min可以最大限度地增強卵清蛋白的抑菌活性;而對于金黃色葡萄球菌需要乳酸處理30 min以上才能增強卵清蛋白的抑菌活性(30 min處的抑菌活高于0 min),處理60 min才能最大限度地增強卵清蛋白的抑菌活性。

圖2 乳酸處理時間對卵清蛋白抑菌活性的影響

這可能是由于不同細菌的細胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)不同,大多數(shù)的革蘭氏陰性菌以及部分芽胞桿菌的肽聚糖合成路徑為二氨基庚二酸(DAP)型,此種類型的肽聚糖層短肽之間是直接交聯(lián)的,形成的肽聚糖層相對稀疏;而葡萄球菌的肽聚糖合成路徑為賴氨酸(Lys)型,短肽間需要肽橋連接,合成的肽聚糖厚且致密[18-19]。因此,乳酸分子進入金黃色葡萄球菌細胞膜內(nèi)部的過程較慢,從而其起細胞透化作用所需的時間較長。在乳酸處理60 min以內(nèi),卵清蛋白的抑菌活性隨處理時間的增加逐漸上升;當乳酸處理超過60 min時,卵清蛋白對大部分菌株的抑菌活性下降,可能是由于細菌對外界環(huán)境具有適應(yīng)能力。

2.2.3 不同乳酸處理溫度對卵清蛋白抑菌活性的影響 由圖3可以看出,乳酸處理溫度對卵清蛋白抑菌活性的影響在不同菌株之間存在差異。

對于革蘭氏陽性菌(圖3A和3B),在4 ℃下進行乳酸處理時,卵清蛋白對細菌的抑菌活性最強;對于革蘭氏陰性菌(圖3C和3D),在25 ℃(室溫)下進行乳酸處理可以較好地增強卵清蛋白的抑菌活性;對于四種致病微生物,在25 ℃下進行乳酸處理均可以起到較強的抑菌作用。在30、40和50 ℃下進行乳酸處理,對卵清蛋白抑菌活性的增效作用均不理想,可能是因為溫度升高使乳酸的解離程度增大,從而使可以進入細胞的未解離的乳酸小分子的量減少,造成乳酸的透化作用降低,對卵清蛋白抑菌活性的增效作用降低。而37 ℃下乳酸處理對卵清蛋白抑菌活性增效明顯則可能是由于37 ℃為細菌的最適生長溫度,此環(huán)境下細菌對外界環(huán)境敏感,有助于乳酸的透化作用。

圖3 乳酸處理溫度對卵清蛋白抑菌活性的影響

不同細菌的最適生長溫度不同,對溫度的敏感性也不同;另一方面,溫度與乳酸的解離程度和乳酸溶液的pH有關(guān),因此,乳酸處理溫度對菌株生理特性的影響是多因素共同作用的結(jié)果,是一個復雜的過程。

2.3 最佳乳酸處理條件下卵清蛋白的抑菌活性增加率及顯著性分析

當在各自的最佳條件下進行乳酸處理后,卵清蛋白(6.4 mg/mL)對四種致病菌的抑菌活性與未經(jīng)乳酸處理時的抑菌活性對比如表4所示,從表4中可以看出乳酸將卵清蛋白對燦爛類芽胞桿菌的抑菌活性從原來的0.8113增加到0.8746,增效了7.802%;將卵清蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌活性增效了26.904%;對于土變形桿菌,卵清蛋白的抑菌活性由原來的0.5862增長為0.9014,活性增長53.770%;對大腸桿菌O157∶H7,乳酸將卵清蛋白的活性增長了131.321%(由0.3148到 0.7282)。這些結(jié)果表明使用亞致死濃度的乳酸處理細菌可以極顯著增強細菌對卵清蛋白的敏感性(p<0.01),從而有效地增強了卵清蛋白的抑菌活性,尤其是大大增強了卵清蛋白對革蘭氏陰性菌的活性。

表4 乳酸處理前后卵清蛋白抑菌活性變化及顯著性分析表

2.4 乳酸處理前后卵清蛋白的抑菌動力學曲線

圖4A～D分別為乳酸處理前后卵清蛋白對四種測試菌的抑菌動力學曲線。如圖4A燦爛類芽胞桿菌,由于乳酸處理對其造成亞損傷,在長達16 h內(nèi)都生長不良,但16 h后恢復生長且生長速度很快。卵清蛋白對該菌的MIC為0.4 mg/mL,濃度大于0.4 mg/mL的卵清蛋白單獨作用可完全抑制細菌生長長達24 h。MIC濃度下的卵清蛋白單獨作用,細菌在8 h后由于環(huán)境適應(yīng)性開始生長,但生長速度十分緩慢。經(jīng)乳酸處理后,使用MIC濃度的卵清蛋白即可完全抑制細菌生長長達24 h。表明MIC濃度的卵清蛋白單獨作用只能抑制或減緩細菌的生長,而經(jīng)乳酸處理細菌后,MIC濃度的卵清蛋白可起到殺菌作用。這也暗示了乳酸對細菌的亞損傷可能是增效卵清蛋白抑菌活性的方式之一。乳酸增效后降低了卵清蛋白的使用濃度并延長了抑菌時間。

如圖4B金黃色葡萄球菌,卵清蛋白的MIC為6.4 mg/mL,單獨使用6.4 mg/mL的卵清蛋白可以有效抑制金黃色葡萄球菌的生長速度,而經(jīng)乳酸增效后,MIC濃度的卵清蛋白則可以將原有的菌數(shù)量減少至更低(OD值下降),表明乳酸處理金黃色葡萄球菌后,MIC濃度的卵清蛋白可以起到殺菌作用,且具有較好的時效性,可以在24 h內(nèi)完全抑制其生長。對于其余濃度的卵清蛋白(1.6和0.4 mg/mL),經(jīng)乳酸增效后,抑菌趨勢與單獨使用乳酸處理獲得的趨勢相同,表明乳酸對卵清蛋白的增效作用,一方面與卵清蛋白的濃度有關(guān),另一方面與乳酸本身對細菌的損傷情況有關(guān)。

如圖4C土變形桿菌,乳酸處理后細菌由于受到亞損傷，與生長對照相比生長緩慢。之前的研究表明6.4 mg/mL的卵清蛋白對其的抑菌活性為0.5單位左右,表明卵清蛋白本身對土變形桿菌有一定的抑制作用,但是活性不強,從圖4C中可以看出,6.4 mg/mL的卵清蛋白的確可以減緩該菌的生長速度,但減緩幅度低于亞致死濃度乳酸的作用效果,表明卵清蛋白的這種抑制甚至無法起到對細菌的亞致死作用,作用并不強。乳酸增效后,6.4 mg/mL的卵清蛋白可以明顯抑制該菌生長,此時的抑菌強度強于亞致死劑量乳酸的抑菌作用。另外,其他濃度的卵清蛋白對該菌無明顯的生長抑制作用,即使經(jīng)乳酸增效,獲得的抑菌趨勢與單獨使用乳酸處理時的趨勢相同,表明乳酸的增效作用可能取決于某濃度下的卵清蛋白本身是否對這種細菌具有一定的抑制作用(即使輕微抑制)。

圖4 乳酸處理前后不同濃度的卵清蛋白對四種測試菌的抑菌動力學曲線

如圖4D大腸桿菌O157∶H7,之前的研究表明6.4 mg/mL的卵清蛋白本身對其的抑菌活性在0.3單位左右,表明該濃度下的卵清蛋白對其具有較弱的抑菌活性,乳酸增效的結(jié)果與針對土變形桿菌的相似。即乳酸處理可以顯著增強6.4 mg/mL的卵清蛋白對大腸桿菌O157∶H7的抑菌效果,因為6.4 mg/mL的卵清蛋白本身對大腸桿菌O157∶H7有一定的抑制效果,這再次驗證了之前的推測:乳酸的增效作用取決于某濃度下的卵清蛋白本身是否對細菌有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

通過研究乳酸濃度、乳酸處理時間和處理溫度等因素對卵清蛋白活性的影響,確定了使用0.05%的乳酸在4 ℃下處理40 min可以將卵清蛋白對燦爛類芽胞桿菌的抑菌活性增加7.802%;對金黃色葡萄球菌,用0.05%濃度的乳酸在4 ℃下處理60 min可將卵清蛋白的抑菌活性增大26.904%;在25 ℃下,使用0.15%和0.2%的乳酸分別處理土變形桿菌和大腸桿菌O157∶H7 40 min,卵清蛋白的抑菌活性分別增加53.770%和131.321%。抑菌動力學曲線表明，乳酸對卵清蛋白的抑菌活性的增效不僅表現(xiàn)在抑菌活性方面,還顯著降低了卵清蛋白的使用濃度(p<0.05)，并延長了卵清蛋白的抑菌時間。

目前關(guān)于乳酸增效天然生物抑菌劑的研究較少,且本研究中使用的乳酸濃度低于大多數(shù)研究中報道的抑菌濃度[13,16],使用的卵清蛋白是禽蛋中存在的成分,來源廣泛、價格低廉且天然安全無毒,具有較好的經(jīng)濟實用性。試驗結(jié)果表明，添加低濃度的乳酸處理細菌可以極顯著增加(p<0.01)卵清蛋白對測試菌的抑菌活性,尤其是針對革蘭氏陰性菌,表明將食品級滲透劑如低濃度乳酸與抗菌劑(如卵清蛋白)結(jié)合使用的試驗方案有望應(yīng)用于食品的防腐、清洗或保鮮等領(lǐng)域,應(yīng)用前景廣闊。