表面增強拉曼光譜測定保健品中非法添加物西地那非

吳國萍,周亞紅,李靜泉,李家偉

(1.江蘇警官學院刑事技術系,江蘇南京 210031)2.江蘇省食品藥品與環境犯罪技術檢驗工程實驗室,江蘇南京 210031)

5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑主要作用是抑制磷酸二酯酶的活性,常用于治療勃起障礙,同時也有助于高血壓、充血性心力衰竭、冠狀動脈疾病和心絞痛的治療,屬于處方藥品;服用后會產生諸如頭痛、潮紅、消化不良、視覺異常、血壓重疊下降等不良反應[1]。根據《中華人民共和國食品安全法》規定,向食品、保健品中添加此類物質屬于違法行為,公安機關食藥環偵部門對保健品中非法添加化學成分的打擊一直處于高壓態勢。但是,保健食品及補腎壯陽類中成藥中非法添加5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑(如西地那非、他達拉非等)的現象層出不窮。

目前,對5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑相關檢測的5項標準如國家藥品補充檢驗方法和檢驗項目批準件2009030、食藥監[2016]28號文附件7和國家食品補充檢驗方法BJS201601、BJS201704、BJS201710都是運用液相色譜-質譜聯用儀[1-5]。液質聯用的檢驗方法準確度高,靈敏度高;但分析周期比較長,儀器昂貴,操作復雜[6-10],在公安實戰部門普及率不高。公安食藥環偵部門對功能性保健品中非法添加成分的檢驗是快檢、初篩為陽性結果的協調相關檢測機構進行確證性檢驗。建立功能性保健品中違禁法成分的快速、準確篩查方法,能有利于公安食藥環偵部門主動發現線索。便攜拉曼光譜具有快速、無損、可定量、應用廣泛等優點,表面增強技術(SERS)利用納米尺度的粗糙表面或顆粒體系具有的異常光學增強效應,使吸附在材料表面的分子拉曼信號能提高104～107,表面增強結合拉曼技術可以提供其他檢測技術所達不到的檢測水平,在快檢行業受到越來越多的關注[11-20]。但文獻資料的查閱表明,國內關于拉曼表面增強快速檢驗那非類物質的報道相對較少,僅見王紅梅等[21]采用表面增強拉曼光譜對西地那非類藥物的快速檢測和劉元瑞等[22]采用薄層原位表面增強拉曼光譜法檢測中成藥和保健品中添加的西地那非。

國內便攜拉曼光譜儀器公司提供的表面增強試劑及配套助劑一般受專利保護,使用成本相對較高;本文采用自制表面增強試劑(納米金)與簡智公司提供的表面增強試劑對比研究增強效果,并進一步比較兩者對保健品中西地那非的陽性檢出率;擬將自行研制的表面增強試劑(納米金)推廣于公安食藥環偵部門快檢實驗室,為食藥案件的主動破獲提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西地那非 批號510068-201401,中國食品藥品檢定研究院;21種保健品 來源于某市公安局食藥環偵部門查繳,如表4所示;表面增強劑 簡智公司提供的表面增強試劑及實驗室自制納米金;簡智公司提供的助劑B6;鹽酸、硝酸、硫酸、氯金酸和檸檬酸鈉(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈(HPLC色譜試劑) 德國默克(MERCK)公司。

SSR-3000便攜式拉曼光譜儀 簡智儀器公司;ME104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Tripe QTOF 5600+超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用 美國AB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西地那非標準溶液的配制 精密稱取西地那非標準品,甲醇定容至1 mg·mL-1,作為儲備液Ⅰ,于4 ℃避光貯存,臨用時稀釋備用。

1.2.2 保健品中西地那非的提取 稱取保健品0.1 g,甲醇定容至10 mL,5000 r/min離心5 min,取上清液稀釋100倍作為儲備液Ⅱ,冷藏保存備用。

1.2.3 納米金表面增強劑的制備 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法[23]制備膠體金溶液。分別移取一定體積(0.95、1、1.1、1.15、1.2 mL)濃度為1%的氯金酸至裝有100 mL超純水和磁石的燒杯里,將燒杯放置于磁石加熱攪拌器上,進行恒溫加熱至沸騰之后,迅速打開磁力攪拌器,逐滴加入濃度為1%檸檬酸鈉水溶液1 mL,使其充分反應;反應過程中,溶液顏色變化過程為無色透明-黑色-紫-藍-酒紅色透明狀。繼續進行加熱攪拌至6 min,停止加熱以及攪拌,冷卻至室溫,然后將其放置棕色瓶中避光保存,逐次命名為A1、A2、A3、A4、A5。

1.2.4 助劑的制備

1.2.4.1 助劑B的制備 配制摩爾體積濃度分別為1.71、2、2.4、3 mol·L-1的鹽酸溶液,逐次命名為助劑B1、B2、B3、B4。

1.2.4.2 助劑C的制備 配制摩爾體積濃度分別為2.28、2.67、3.2、4 mol·L-1的硝酸溶液,逐次命名為助劑C1、C2、C3、C4。

1.2.4.3 助劑D的制備 配制摩爾體積濃度為5.14 mol·L-1的硫酸溶液,命名為助劑D。

1.2.5 西地那非拉曼光譜分析

1.2.5.1 拉曼光譜條件 檢測步驟為:激光波長為785 nm,功率為275 MW,掃描范圍為175～3200 cm-1,分辨率為4.5 cm-1。

1.2.5.2 拉曼光譜分析 取100 μL儲備液樣品(或稀釋至一定濃度的西地那非標樣),先加入200 μL表面增強試劑,再加入20 μL助劑用以調節體系酸堿,混合均勻后開始拉曼光譜測試,譜圖采集時間為10 s。

1.2.6 西地那非液質聯用儀分析

1.2.6.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:A:5 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸緩沖溶液 B:乙腈。梯度洗脫程序如表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.6.2 質譜條件 電離方式:電噴霧正(負)離子模式。離子源參數:霧化氣壓力(GS1)50 psi,輔助加熱氣(GS2):50 psi,氣簾氣(CUR):35 psi,干燥氣溫度:500 ℃,離子化電壓:正離子模式5500 V;一級質譜條件:去簇電壓(DP):80 V,碰撞能量(CE):10 V。二級質譜條件:碰撞能量(CE):50 V;碰撞能量范圍(CES):15～20 V。

1.2.6.3 液質聯用儀分析 儲備液Ⅰ稀釋至100 ng·mL-1進行液質聯用儀分析;儲備液Ⅱ稀釋100倍后,微孔濾膜過濾(0.22 μm,有機相)進行液質聯用儀分析。

2 結果與分析

2.1 西地那非標樣的SERS分析

2.1.1 不同表面增強試劑對西地那非標樣SERS分析 采用廠家表面增強試劑、實驗室自制納米金A1、A2、A3、A4及A5,對濃度為0.02 μg·mL-1的西地那非標品進行表面增強分析,結果表明,自制的納米金A2、A3及廠家提供的增強試劑檢測結果為陽性,納米金A2及廠家提供的增強試劑譜圖信息基本一致,如圖1～圖2所示,在645.9、1526.2、1578.0 cm-1等波數處出現強度較強的西地那非類特征峰[21];納米金A3譜圖信息不及納米金A2譜圖信息豐富,且強度弱于A2;自制的納米金A1、A4、A5檢測結果為陰性。因而,可以認為自制納米金A2與廠家提供表面增強試劑功效接近,較有利于那非類成分的檢測。

圖1 廠家表面增強試劑的SERS譜圖

圖2 納米金A2的SERS譜圖

2.1.2 西地那非標樣陽性檢出限的考察 廠家提供表面增強試劑和助劑B6可對0.01 μg·mL-1西地那非陽性檢出;以自制納米金A2結合助劑B、C、D對0.01 μg·mL-1西地那非標樣進行檢測,結果如表2所示。從表2可知,只有助劑C2對0.01 μg·mL-1西地那非標樣陽性檢出。進一步以自制納米金A2結合助劑C2對2、0.02、0.01 μg·mL-1西地那非標樣進行表面增強檢測,1397.8、1526.2以及1580.2 cm-1等特征峰[21]峰強度列舉在表3中,三者的檢驗結果均為陽性。從表3可以看出,隨著濃度的不斷降低,西地那非類特征峰的強度在不斷減弱,在0.01 μg·mL-1的條件下,SERS譜圖出現的特征峰強度較弱,并且有些特征峰開始消失,由此可認為,自制納米金A2結合助劑C2表面增強后對0.01 μg·mL-1西地那非陽性檢出已接近檢出限。

表2 納米金A2、不同助劑對0.01 μg·mL-1 西地那非標樣表面增強效果影響

表3 自制納米金A2表面增強不同濃度的西地那非標樣相關特征峰峰強度

2.2 21種抗疲勞保健品樣品的SERS檢測和液質聯用儀檢測結果

2.2.1 21種保健品樣品液質聯用儀檢測結果 100 ng·mL-1西地那非標樣液質聯用儀分析提取離子流圖和質譜圖如圖3和圖4所示。從圖3和圖4可知,西地那非保留時間為8.59 min,母離子m/z為475,主要碎片離子為 m/z 311、283;21種保健品共22個樣品有21種西地那非陽性檢出,如表4第4欄所示。

圖3 西地那非提取離子流圖

圖4 西地那非的質譜圖

表4 廠家提供表面增強劑及助劑B6與實驗室自制納米金A2及助劑C2實驗結果

2.2.2 21種保健品樣品SERS檢測的結果 分別使用廠家提供的表面增強試劑和助劑B6及實驗室自制納米金A2和助劑C2對22個樣品進行SERS檢測。廠家提供的表面增強試劑檢測結果記為檢測結果A,自制納米金A2以及助劑C2的檢測結果記為檢測結果B,分別如表4第5、6欄和7、8欄所示。表4中匹配度是儀器對分析圖譜與標準圖譜自動比對時提供的分析結果,匹配度越高,說明陽性結果的可靠性越高。

從表4可以看出,檢測結果A中2-1號、4號、6號樣與液質聯用儀不一致,吻合度為86.4%;檢測結果B與保健品的液質聯用儀檢測結果完全一致,吻合度為100%。

2.3 保健品中西地那非的SERS分析條件考察

考慮保健品基質效應對表面增強效果的影響,以表4中陽性檢出,但匹配度為50%的1號、6號和21號樣品為例對表面增強條件進行考察。

2.3.1 不同納米金對保健品中西地那非陽性檢驗效果比對 同用助劑C2,分別運用A2、A3及A5納米金對1號、6號和21號樣品進行SERS檢測,結果如表5所示,其中陽性檢測結果的表面增強圖譜如圖5～圖9所示。

表5 不同納米金對1號、6號、21號樣品表面增強效果影響

圖5 納米金A21號樣品的SERS譜圖

圖6 納米金A3測定1號樣品的SERS譜圖

圖7 納米金A5測定1號樣品的SERS譜圖

圖8 納米金A2測定6號樣品的SERS譜圖

圖9 助劑C2測定21號樣品的SERS譜圖

由表5可知,6號和21號樣品納米金A3和A5檢測結果為陰性,其余的都是西地那非陽性檢出;圖5～圖8及圖15中西地那非特征峰出峰明顯,納米金A2更能有效檢測出保健品中那非類成分;與文中2.1.1所得結論一致,保健品基質對表面增強影響不大。

2.3.2 不同助劑對部分保健品中西地那非陽性檢驗效果比對 同用納米金A2,比較廠家助劑B6、助劑B(B1、B2、B3、B4)、助劑C(C1、C2、C3、C4)以及助劑D對1號、6號和21號檢測效果的影響;表6列舉了陽性檢出結果,表面增強圖譜如圖10～圖15所示。分別比較圖10、圖11、圖12,圖13、圖14和圖9、圖15,助劑C2的特征峰增強效果更明顯。因而,可以認為助劑C2更能有效檢測出保健品中那非類成分,與文中2.1.2所得結論一致,說明保健品基質影響不大。

表6 納米金A2、不同助劑對1、6、21號樣品表面增強效果影響

圖10 助劑C2測定1號樣品的SERS譜圖

圖11 助劑B2測定1號樣品的SERS譜圖

圖12 助劑D測定1號樣品的SERS譜圖

圖13 廠家助劑B6測定6號樣品的SERS譜圖

圖14 助劑C2測定6號樣品的SERS譜圖

圖15 助劑B2測定21號樣品的SERS譜圖

3 結論

本文運用便攜式拉曼光譜(SERS)技術、自制納米金表面增強試劑對西地那非標樣及保健品中西地那非進行檢測。結果表明,自制納米金表面增強試劑可對濃度為0.01 μg·mL-1西地那非陽性檢出,21種保健品中西地那非的檢出效果稍強于廠家提供的增強試劑檢測效果,與飛行時間-液質聯用儀(QTOF-LC-MS)分析結果一致。本文實驗結果為SERS技術在抗疲勞類保健品中的那非類快速現場檢測提供可行性方案,為公安食藥環偵部門主動發現線索提供技術保障。初步認為自制納米金A2結合助劑C2表面增強效果不差于廠家提供的表面增強試劑,應能滿足保健品中西地那非的檢測。