高速逆流色譜法分離制備小葉金錢草中楊梅苷與槲皮苷

宋道光,徐順連,樊鑫宇,陳 志

(青海師范大學生命科學學院,青藏高原藥用動植物資源重點實驗室,青海西寧 810008)

小葉金錢草(HydrocotylesibthorpioidesLam.)為傘形科天胡荽屬植物天胡荽,中國傳統中藥之一,為多年生草本植物。小葉金錢草通常生長在海拔475～3000 m濕潤的草地、河溝邊和林下,廣泛分布于中國的許多地區,如四川、廣西、貴州等地[1]。目前,小葉金錢草的化學成分含有黃酮類、酚類和香豆素類化合物[2]。超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析顯示小葉金錢草含有酚類和類黃酮,如兒茶素、表兒茶素、槲皮素和綠原酸,并被證明這是小葉金錢草抗氧化活性的主要成分[3],此外,其在體外還具有抗登革熱病毒[4]和抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性[5]。但截至目前,小葉金錢草只作為民間用藥,尚未被中國藥典收錄,因此對小葉金錢草化學成分及藥理活性的深入研究具有重要意義。

雖然傳統的硅膠柱層析可以分離出許多化合物,但它需要大量的溶劑,且不能分離具有相似結構和極性的化合物。而高速逆流色譜(high speed counter-current chromatography,HSCCC)是以化合物在兩相不互溶的溶劑中分配系數的差異為原理的液液分配色譜,無需固體材料做固定相,無不可逆吸附等作用,具有樣品回收率高、成本低、儀器操作簡便等特點,近年來在天然產物分離等領域得到了廣泛應用[6-7]。

本研究采用高速逆流色譜法分離小葉金錢草中的兩種黃酮成分楊梅苷和槲皮苷,有利于進一步研究小葉金錢草的化學成分及其藥效,這為小葉金錢草的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小葉金錢草 青海師范大學植物學陳志教授鑒定,為天胡荽屬植物天胡荽,HydrocotylesibthorpioidesLam.),購于西寧城北百信大藥房;葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20) 安徽博美生物科技有限公司;氯仿、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、乙腈、甲酸 分析純,高效液相色譜所用的乙腈為色譜純,天津市百世化工有限公司;水 二次蒸餾水。

RE.52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;真空脫氣過濾裝置 美國Waters公司;KJ-11030AL型超聲波清洗器 深圳市科潔超聲科技有限公司;Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司;Waters 2998 PAD二極管陣列檢測器 美國Waters公司;HSCCC TBE-300B型高速逆流色譜儀(柱體積300 mL) 中國上海同田生化技術有限公司;N2000雙通道色譜工作站 浙江大學智達信息工程有限公司;核磁共振儀 瑞士Bruker-500 MHz NMR(AVANCE III HD)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小葉金錢草乙酸乙酯及分離樣品的制備 將購買的小葉金錢草藥材用中藥粉碎機粉碎,過40目篩。稱取20 kg粉末分次置于超聲波清洗器,按液料比10∶1加入70%(v:v)乙醇溶液,于600 W、40 kHz、60 ℃提取1 h,過濾除去藥渣,將藥渣重復提取4次。合并提取液減壓濃縮,得到棕褐色粘稠浸膏。浸膏用蒸餾水混懸,依次用10倍量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次。取乙酸乙酯萃取液回收溶劑并濃縮得到小葉金錢草乙酸乙酯萃取物,4 ℃避光保存備用。石油醚及正丁醇萃取物的化學成分另做研究。

取5 g乙酸乙酯萃取物,用30 mL蒸餾水超聲溶解并過0.45 μm濾膜,Sephadex LH-20柱層析分離(3 cm×80 cm),分別用水、10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%甲醇洗脫,每個比例洗脫2個柱體積,1/20柱體積為一餾分,收集75%甲醇洗脫餾分,合并色譜峰保留時間相同的餾分(HPLC檢測條件見1.2.2),旋蒸除去溶劑并于-70 ℃冷凍干燥24 h,得到Sephadex LH-20分離樣品。其余甲醇洗脫餾分的化學成分另做研究。

1.2.2 分離樣品的高效液相色譜檢測 取一定量乙酸乙酯+Sephadex LH-20分離樣品,用乙腈溶解,0.45 μm針頭過濾器過濾后,進行HPLC分析,其中產物的純度按面積歸一化法計算。

HPLC檢測條件:色譜柱:Waters 600 SunFireTMC18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.1%甲酸(15%～40%乙腈,0～70 min),流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃,檢測波長254 nm。進樣10 μL分析。高效液相色譜(HPLC-PAD)紫外光譜掃描范圍:200～400 nm。

1.2.3 高速逆流色譜溶劑系統的選擇

1.2.3.1 溶劑系統的確定 參考高速逆流色譜分離黃酮類化合物的相關報道選擇溶劑系統[8],如乙酸乙酯、正己烷、正丁醇和水等,按照溶劑極性的不同配制比例均為2∶1∶1的乙酸乙酯-正丁醇-水(1號溶劑)和正己烷-正丁醇-水(2號溶劑)系統,考察此兩個比例系統對分配系數K的影響。

1.2.3.2 正己烷-正丁醇-水系統比例的確定 按照正己烷-正丁醇-水的體積比配制溶劑系統,比例依次為:1∶1∶1、1∶2∶2、1.5∶1∶1、1.75∶1∶1、1∶2∶1、2∶2∶1和2∶3∶1(3～9號溶劑)。分別考察正己烷和正丁醇對分配系數K的影響。

1.2.3.3 K值的測定 通過高效液相色譜測定目標化合物在溶劑系統中的分配系數K,K值定義為上相中目標化合物的色譜峰面積(S上)除以下相中目標化合物的色譜峰面積(S下)(K=S上/S下)。篩選K值在0.2～5.0的溶劑系統用于高速逆流色譜[9]。另一方面,兩組份的分離度(α=K1/K2,K1>K2)應該大于1.5[10]。

分配系數的測定:將適量的樣品粉末溶解在適當量預平衡的兩相溶劑系統中,并置于分液漏斗中。劇烈搖動分液漏斗以徹底平衡兩相樣品,并取等體積的兩相蒸發至干。然后將殘余物用1 mL乙腈溶解過0.45 μm濾膜并按照1.2.2中方法進行HPLC分析。

1.2.4 高速逆流色譜分離制備 配制正己烷-正丁醇-水(1.75∶1∶1,v∶v∶v)兩相溶劑系統,于分液漏斗中充分振搖后在室溫下靜置10 h,將上下相分離并超聲脫氣20 min,上相為固定相(正己烷、正丁醇)下相為流動相(水)。以20 mL/min的流速將脫氣后的上相泵入主機。待主機中充滿上相后,啟動主機正相旋轉按鍵FWD,調整主機轉速為900 r/min,儀器轉速穩定后再以2 mL/min的流速泵入超聲脫氣后的下相。待流動相流出主機后,平衡數分鐘待基線平穩后計算固定相保留率(Sf),計算方法為:Sf(%)=[(螺旋管體積-流出固定相體積)/螺旋管體積]×100。

開啟TBD 2000檢測系統,設置檢測波長為254 nm,采集數據。取1.2.1中Sephadex LH-20分離樣品50 mg,用10 mL上相液體溶解,由進樣閥上樣,記錄色譜圖,收集各分離組分。

1.2.5 化合物核磁共振波譜表征 通過對已分離化合物進行1H NMR和13C NMR譜圖的測定,將化合物1H NMR和13C NMR圖譜在MestReNova中處理,并對化學位移進行積分和偶和常數(J)的計算。J的計算方法為:(低場化學位移-高場化學位移)×核磁兆數。1H NMR二重峰、雙二重峰(分別表示為d及dd)需計算J值,單峰(s)、三重峰(t),以上不計算J值。通過與文獻化合物報道數據進行1H NMR化學位移及J和13C NMR化學位移比對,結果一致即確定化合物結構,結構式通過ChemBioDraw 14.0畫出。

2 結果與分析

2.1 小葉金錢草乙酸乙酯提取物及Sephadex LH-20分離樣品

按照1.2.2方法得到小葉金錢草乙酸乙酯萃取物及Sephadex LH-20分離樣品的HPLC色譜圖見圖1。由圖1a可知,小葉金錢草乙酸乙酯萃取物所含化學成分較為復雜,而經Sephadex LH-20純化后(圖1b)HPLC色譜峰較少,有利于分配系數摸索及溶劑系統的優化選擇。由圖1b可知,峰1、峰2為高速逆流色譜目標分離成分,其保留時間分別為18.974和26.282 min。圖1c和圖1d分別為峰1和峰2的紫外光譜,色譜峰在峰帶I:300～400 nm及峰帶II:220～280 nm有明顯紫外吸收,符合黃酮類化合物紫外光譜吸收特征,即峰1和峰2為黃酮類化合物。

圖1 小葉金錢草乙酸乙酯部位(a)、Sephadex LH-20分離樣品(b)的高效液相色譜圖及峰1(c)、峰2(d)的紫外光譜

2.2 HSCCC分配系數的優化

HSCCC實現好的分離效果的前提為:具有合適分配系數的兩相溶劑系統、具有合適的分配系數(0.2～5.0)、兩相溶劑分層時間短(小于30 s)和固定相有較高的保留率。

2.2.1 溶劑系統的確定 在初步的試驗當中,目標化合物極易溶于乙酸乙酯和水。在表1中可以看出,1號溶劑乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶1,v∶v∶v)分配系數過大,因此不適合作為高速逆流色譜溶劑系統。在2號系統中將乙酸乙酯替換為正己烷后體系的分配系數大為改善,但表1中2號系統中1號化合物分配系數較小,會過早地和雜質一同隨流動相流出,化合物純度將無法保證,故不選用2號溶劑系統。因此,下一步通過調整正己烷和正丁醇的比例來探索正己烷-正丁醇-水溶劑系統的最適分配系數。

2.2.2 正己烷-正丁醇-水比例的確定 由表1、表2可知,2號及3～9號溶劑系統的分配系數范圍在0.3～11.0之間。在上相作為流動相和下相作為固定相的溶劑體系中,分配系數越小出峰時間越早[11]。通過調整正己烷和正丁醇的比例時可以發現,當增加正己烷或減小正丁醇的比例時,化合物的分配系數減小而分離度增加。由3號及7號、2號及8號和8號及9號可知,增加正丁醇的比例對化合物的分配系數影響較大,即延長了逆流色譜出峰時間。綜合考慮,通過調整正己烷的比例可以在保證分離度的前提下盡可能地縮短分離時間,節約溶劑。因此選用6號溶劑系統正己烷-正丁醇-水(1.75∶1∶1,v∶v∶v)進行高速逆流色譜分離目標物。

表2 小葉金錢草提取物在正己烷-正丁醇-水溶劑體系中的分配系數 K

2.3 HSCCC分離結果

采用溶劑系統正己烷-正丁醇-水(1.75∶1∶1,v∶v∶v),參照1.2.3中固定相保留率計算方法,Sf=[(300-104)]/300×100%=65.3%。按照1.2.4的方法進行高速逆流色譜分離,得到3個分離組分(圖2)并進行HPLC分析。峰I為混亂雜質峰,沒有進一步分離價值。峰Ⅱ～Ⅲ樣品HPLC分析結果見圖3,其中峰Ⅱ圖3a、峰III圖3b為目標化合物,保留時間(Rt)和純度分別為:峰Ⅱ,Rt=18.974 min,97.85%;峰Ⅲ,Rt=26.282 min,95.42%。圖3中小圖對應各色譜峰的紫外吸收光譜,由紫外光譜分析得知,色譜峰紫外吸收在峰帶I:300～400 nm及峰帶Ⅱ:220～280 nm有明顯紫外吸收,符合黃酮類化合物紫外光譜吸收特征,故所分離得到的兩種化合物為黃酮類化合物。樣品冷凍干燥后得峰Ⅱ 18.63 mg,峰Ⅲ 17.49 mg。

圖2 小葉金錢草乙酸乙酯部位分離樣品的高速逆流色譜圖

圖3 峰Ⅱ(a)、Ⅲ(b)組分的 HPLC色譜圖

2.4 結構表征

化合物1的1H NMR和13C NMR數據如下:1H NMR(DMSO-d6,500 MHz,ppm):δ 12.69(1H,s,5-OH),9.26(4H,br s,3′,4′,5′,7-OH),6.90(2H,s,2′,6′-H),6.37(1H,d,J=1.9 Hz,8-H),6.20(1H,d,J=1.8 Hz,6-H),5.12(1H,s,1″-H),3.15-3.99(4H,m,rha-2,3,4,5),0.85(3H,d,J=6.2 Hz,CH3);13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz,ppm):δ 177.2(C-4),164.9(C-7),161.8(C-5),157.9(C-8a),156.9(C-2),146.25(C-3′,5′),136.9(C-4′),134.7(C-3),120.0(C-1′),108.4(C-2′,6′),104.4(C-4a),102.4(C-1″),99.2(C-6),94.0(C-8),71.7(C-4″),71.0(C-3″),70.9(C-2″),70.5(C-5″),18.0(C-6″)。根據已報道文獻比對[12],化合物1為楊梅苷(Myricitrin),其結構式見圖4(1)。1H NMR和13C NMR圖譜分別見圖5a和圖5b。

圖4 楊梅苷(1)和槲皮苷(2)的化學結構

圖5 楊梅苷(a,b)和槲皮苷(c,d)的核磁共振氫譜碳譜(500 MHz,DMSO-d6)

化合物2的1H NMR和13C NMR數據如下:1H NMR(DMSO-d6,500 MHz,ppm):δ 12.66(1H,s,5-OH),9.74(3H,br s,7,3′,4′-OH),7.31(1H,d,J=2.0 Hz,2′-H),7.26(1H,dd,J=2.0 Hz 和 J=8.3 Hz,6′-H),6.87(1H,d,J=8.3 Hz,5′-H),6.39(1H,d,J=1.7 Hz,8-H),6.20(1H,d,J=1.8 Hz,6-H),5.27(1H,s,1″-H),3.14-3.99(4H,m,rha-2,3,4,5),0.83(3H,d,J=6.1 Hz,CH3);13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz,ppm):δ 178. 2(C-4),165.1(C-7),161.8(C-5),157.7(C-2),157.0(C-8a),148.9(C-4′),145.7(C-3′),134.6(C-3),121.6(C-6′),121.2(C-1′),116.1(C-5′),116.0(C-2′),104.4(C-4a),102.3(C-1″),99. 3(C-6),94.2(C-8),71.6(C-4″),71.1(C-2″),70.8(C-3″),70.5(C-5″),17.9(C-6″);根據已報道文獻比對[13],化合物2槲皮苷(Quercitrin),其結構式見圖4(2)。1H NMR和13C NMR圖譜分別見圖5c和圖5d。

3 結論

本文采用高速逆流色譜法首次從小葉金錢草中分離制備兩種黃酮苷類化合物,確定兩相溶劑系統為正己烷-正丁醇-水(1.75∶1∶1,v∶v∶v),分配系數達到0.54和1.54,經1H NMR和13C NMR確定此兩種物質分別為楊梅苷和槲皮苷,其純度分別達到97.85%和95.42%。經實驗研究建立從小葉金錢草分離純化楊梅苷和槲皮苷的HSCCC方法,為進一步研究小葉金錢草的化學成分、藥效以及綜合利用奠定了一定的理論基礎。