外源H2S對貨架及低溫下采后草莓果實抗氧化活性的影響

李小娟,李明笑,聶鈺洪,周曉微,張 蓓,李 萌,*

(1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.河南省口岸食品檢驗檢測所,河南鄭州 450003)

草莓(Fragaria×ananassaL.)因其鮮紅的果面色澤,香甜氣味和多汁性等特性,深受國內外廣大消費者喜愛。但由于草莓果實采后易軟、風味劣變、顏色暗淡和營養損失等原因,嚴重影響其在貯藏、運輸及銷售環節中品質。目前現有的草莓貯藏保鮮技術研究主要分化學、物理和生物等幾大類,常見的貯藏保鮮技術有涂膜[1]、化學保鮮劑[2]、氣調[3]、低溫冷藏、熱處理[4-5]、輻射[6]等,氣調保鮮技術在應用過程中更顯優勢。目前已有的氣調保鮮技術主要是在低溫貯藏基礎上,通過高濃度CO2[7]、高O2[8]、N2、NO[9]、氣調包裝MAP[10]、減壓處理等,抑制呼吸、蒸發、酶活性及微生物作用,從而延長草莓貯藏壽命,維持草莓鮮果品質。

H2S是繼一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后發現的第三種具有調控植物生理代謝作用的氣體信號分子[11]。在植物中,已證實H2S能夠關閉葉片氣孔,減弱其呼吸作用[12-13]。已有研究發現H2S可延緩常溫下草莓果實硬度下降速度,提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸還原酶(APX)以及谷胱甘肽還原酶(GR)活性,抑制多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,下調果實衰老相關基因表達,清除體內活性氧(ROS)積累[14]。除了抗氧化酶系統以外,植物體內還存在主要由酚類物質、黃酮類物質、抗壞血酸及還原型谷胱甘肽等另一類非酶抗氧化系統[15],而該系統在草莓H2S保鮮中所起作用還未見研究。

本試驗基于非酶抗氧化系統,對比在貨架(20 ℃)和低溫(2 ℃)貯藏過程中H2S供體NaHS對草莓果實中花青素、丙二醛(MDA)、總酚(TP)及抗氧化活性(氧化自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除力、鐵離子還原能力(FRAP)以及ABTS自由基清除能力)的影響,為其采后貯藏提供理論依據,探索NaHS作為草莓新型保鮮技術的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘甜查理’草莓 于2018年4月采自河南省中牟市孟莊村果園,選擇大小均一、無機械損傷、無病蟲害的果實,并立即運回鄭州輕工業學院食品與生物工程學院實驗室進行處理；硫代巴比妥酸、福林酚、沒食子酸、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽、水溶性維生素E(trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪、2,2′-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、過硫酸鉀 上海Sigma-Aldrich公司;其他試劑 均為國產分析純。

HC-3618R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;T-6型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;F-7000型熒光分光光度計 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果實預處理 將果實隨機分成5組,每組用果540個,然后將各組果實分別放入3個5 L塑料密封保鮮盒(180個果實/盒),每組保鮮盒中分別放入500 mL水(對照)、500 mL含有0.4 mmol/L NaHS、500 mL含有0.8 mmol/L NaHS、500 mL含有1.6 mmol/L NaHS和500 mL含有3.2 mmol/L NaHS的水溶液,20 ℃黑暗條件下處理24 h,將處理后的果實分別置于相對濕度為75%、20 ℃下3 d以及2 ℃下9 d,每個時間點各處理用果90個,每個重復30個。處理后的草莓果實樣品直接用于花青素及丙二醛含量的測定。

將上述經過處理的各組草莓果實樣品進一步冷凍粉碎處理:取草莓果實樣品置入研缽,倒入液氮研磨樣品,研磨棒快速研磨1 min左右,磨成粉末狀,稱取0.5 g粉碎樣品,加入5 mL乙醇∶丙酮(7∶3,v/v)溶液,勻漿后于4 ℃下10000 r/min離心20 min,收集上清液于-20 ℃貯藏,用于總酚(TP)含量、氧化自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力(FRAP)、ABTS自由基清除能力等各項指標的測定。

1.2.2 花青素含量測定 參照Fuleki和Francis[16]測定果實中花青素含量,取0.5 g果肉加入5 mL含有10%鹽酸的甲醇溶液,置于20 ℃黑暗條件下24 h,然后在4 ℃下10000 r/min離心20 min,取上清液測定530、620和650 nm處吸光度,按下式計算花青素含量:

花青素含量(μg/g)=[(A530-A620)-0.1×(A650-A620)]/46200

1.2.3 丙二醛(MDA)含量測定 參照Hodge等[17]硫代巴比妥酸法測定MDA含量,取2 g果肉加入5 mL 10%三氯乙酸溶液,4 ℃下10000 r/min離心15 min,取2 mL上清液和2 mL 0.67%硫代巴比妥酸混合,沸水浴20 min后,冰水浴5 min終止反應,測定450、532和600 nm處吸光度,按下式計算MDA含量:

MDA含量(μmol/kg)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

1.2.4 總酚(TP)含量測定 參照Du等[18]福林酚法測定TP含量。取0.05 mL上述提取液與0.25 mol/L Folin-Ciocalteu混勻,3 min后加入1 mol/L Na2CO3反應,20 ℃黑暗條件下孵育2 h后,測定765 nm處吸光度,根據沒食子酸繪制標準曲線,所得回歸方程為y=6.8393x+0.0081,R2=0.9775。沒食子酸標準品溶液在0～0.08 mg濃度范圍,計算TP含量。

1.2.5 氧化自由基吸收能力(ORAC)測定 參照Thaipong等[19]方法,根據草莓果實ORAC測定預實驗結果,將上清液稀釋20倍,取25 μL稀釋液與63 nmol/L熒光素和6 mmol/L 2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽混合,用熒光分光光度計測定,激發波長485 nm,發射波長520 nm,根據trolox繪制標準曲線,所得回歸方程為y=6.9447x+11.722,R2=0.9583。trolox標準品溶液在0～3.5 μmol濃度范圍,計算ORAC氧化自由基吸收能力。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定 參照Peter等[20]方法,取20 μL稀釋液與62.5 μmol/L DPPH混合,37 ℃暗反應30 min,冷卻至室溫后,在517 nm處測定吸光度,根據trolox繪制標準曲線,所得回歸方程為y=14.63x-0.0161,R2=0.9345。trolox標準品溶液在0～0.08 μmol濃度范圍,計算DPPH自由基清除能力。

1.2.7 鐵離子還原能力(FRAP)測定 參照Peter等[20]方法,取75 μL稀釋液與反應液(反應液組成:250 mmol/L 醋酸緩沖液,8.3 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪,16.7 mmol/L FeCl3,按體積比10∶1∶1混合)混合,37 ℃暗反應10 min,冷卻至室溫后,測定在593 nm處吸光度,根據trolox繪制標準曲線,所得回歸方程為y=51.672x-0.0753,R2=0.9187。trolox標準品溶液在0～0.08 μmol濃度范圍,計算FRAP鐵離子還原能力。

1.2.8 ABTS自由基清除能力測定 參照Peter等[20]方法,取35 μL稀釋液與反應液(反應液組成:3.5 mmol/L ABTS和1.3 mmol/L過硫酸鉀)混合,30 ℃暗反應2 h,冷卻至室溫后,在743 nm處測定吸光度,根據trolox繪制標準曲線,所得回歸方程為y=0.0097x-0.0657,R2=0.937。trolox標準品溶液在0～0.2 μmol濃度范圍,ABTS自由基清除能力。

1.3 數據處理

本試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析,利用Duncan’s新復極差法進行多重比較,p<0.05表示差異顯著,采用Microsoft Excel 2010軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 20和2 ℃下NaHS對花青素含量的影響

草莓中花青素含量變化是其成熟的重要標志之一。由圖1可以看出,無論在20 ℃還是2 ℃貯藏條件下,各處理組果實花青素含量均隨貯藏時間延長而逐漸增加,但NaHS能抑制果實中花青素積累,其中3.2 mmol/L NaHS處理組果實花青素含量最低。此外,溫度也是影響花青素合成的重要因素之一,利用低溫延長果實壽命是國內外貯藏保鮮的主要方式,本試驗發現經NaHS處理的草莓果實在低溫環境下仍能有效抑制花青素合成,延緩果實衰老。Hu等[14]研究發現NaHS對草莓果實保鮮效果呈劑量依賴性,本試驗同樣驗證了此項論斷。此外,受供試品種不同的影響,NaHS最適作用劑量也發生改變。例如:‘寶嬌’草莓NaHS最適應用劑量為0.8 mmol/L[14],但對于‘甜查理’，雖然0.4和0.8 mmol/L NaHS能夠抑制花青素積累,但其作用效果低于1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組。

圖1 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓花青素含量的影響

2.2 20和2 ℃下NaHS對MDA含量的影響

果實衰老過程中質膜過氧化產物MDA不斷積累,會造成細胞膜通透性增加,嚴重時導致細胞膜破裂,胞內內含物外泄,因此,通過監測果實中MDA含量變化能夠反映其NaHS作用效果。由圖2A可以看出,相比2 ℃貯藏的果實,各處理組果實在20 ℃貯藏條件下MDA含量隨貯藏時間延長迅速增加,但NaHS能夠抑制MDA積累,其中1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組果實中MDA含量從貯藏開始到貯藏后2 d一直維持在較低水平,保持果實內穩定的細胞膜通透性。從圖2B可知,降低貯藏溫度可延緩果實中MDA積累。此外,經不同濃度NaHS處理的果實其MDA積累明顯減緩,特別是3.2 mmol/L NaHS處理組,推測可能與H2S較強的還原性有關,進入到果實內的H2S通過與清除MDA的相關酶等(如:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、氧化物酶(POD)和脂氧合酶(LOX))結合,保護較高的酶活性[14],進而清除體內多余的MDA,穩定細胞結構。

圖2 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓MDA含量的影響

2.3 20和2 ℃下NaHS對TP含量的影響

圖3可以看出,無論在20 ℃還是2 ℃貯藏條件下,對照組果實總酚含量隨貯藏時間延長無明顯差異。在20 ℃貯藏3 d時,0.4 mmol/L NaHS處理未能改變草莓中總酚含量,但0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS處理果實總酚含量分別高于對照組果實12.92%、27.53%和11.47%。在2 ℃貯藏過程中,NaHS各處理組較對照組變化差異不顯著(p>0.05),說明NaHS對酚類物質代謝調控可能受到溫度的影響,但NaHS仍能延緩果實成熟,說明草莓果實中存在其他調控機制,參與并影響果實貯藏壽命。

圖3 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓TP含量的影響

2.4 20和2 ℃下NaHS對ORAC的影響

為系統地分析H2S對草莓果實抗氧化活性的影響,本試驗對ORAC、DPPH自由基清除力、FRAP以及ABTS自由基清除能力進行分析。由圖4A和B可以看出,在20 ℃和2 ℃貯藏過程中,處理組與對照組果實中ORAC均隨貯藏時間延長而迅速上升。20 ℃貯藏3 d以及2 ℃貯藏9 d后,0.4 mmol/L NaHS處理組果實中ORAC分別低于對照組31.68%和11.16%,但0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組的氧自由基吸收能力顯著高于對照組(p<0.05),且1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組在整個貯藏過程中均保持較高的抗氧化活性,說明在1.6～3.2 mmol/L NaHS濃度下,NaHS有利于激活并提高果實內ORAC,進而降低果實內自由基積累。

圖4 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓氧自由基吸收能力的影響

2.5 20和2 ℃下NaHS對果實DPPH自由基清除力的影響

由圖5A可知,從20 ℃貯藏開始到貯藏1 d后,對照組果實DPPH自由基清除力下降了18.51%,隨后DPPH自由基清除力變化無明顯差異。各NaHS處理組DPPH自由基清除力在整個貯藏過程中均高于對照組,其中貯藏3 d后,3.2 mmol/L NaHS處理組DPPH自由基清除力最高,1.6和0.8 mmol/L NaHS處理組次之,0.4 mmol/L NaHS處理組最低。由圖5B可知,在2 ℃貯藏條件下各處理DPPH自由基清除力均呈先上升后下趨勢。對照組果實在貯藏9 d后DPPH自由基清除力降低到14.76 μmol/g,而0.4、0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組的DPPH自由基清除力分別為16.75、18.29、19.05和17.92 μmol/g,均顯著高于對照處理組(p<0.05),表明NaHS能夠穩定果實DPPH自由基清除力。

圖5 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓DPPH自由基清除力的影響

2.6 20和2 ℃下NaHS對果實FRAP的影響

由圖6可知,在20 ℃貯藏過程中對照組FRAP隨貯藏時間延長逐漸下降,而經NaHS處理的果實中FRAP均呈上升趨勢,且在貯藏2 d后達到高峰隨后下降,其中3.2 mmol/L NaHS處理組果實FRAP在貯藏第2 d最高,高于對照組73.68%。在2 ℃貯藏過程中,各處理組FRAP均隨貯藏時間延長逐漸下降,貯藏9 d后0.4、0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組分別高于對照組10.67%、11.37%、12.89%和18.02%。上述結果表明,NaHS可激活20 ℃貯藏下果實內FRAP,提高其抗氧化活性,但在2 ℃下NaHS對FRAP的激活作用明顯均減弱。

圖6 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓鐵離子還原能力的影響

2.7 20和2 ℃下NaHS對ABTS自由基清除能力的影響

由圖7可知,在20或2 ℃貯藏過程中,各處理組ABTS自由基清除能力均隨貯藏時間延長呈下降趨勢。對照組ABTS自由基清除能力在20 ℃貯藏3 d后下降了33.06%,而0.4、0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS處理組分別下降20.66%、10.33%、12.40%和15.50%,均顯著高于對照處理組(p<0.05)。在2 ℃貯藏9 d后,除0.4 mmol/L NaHS處理組保持較高的ABTS自由基清除能力,其他NaHS處理組較對照組變化差異不顯著(p>0.05)。上述結果表明,NaHS能夠保持20 ℃貯藏過程中較高的ABTS自由基清除能力,但在2 ℃下,NaHS對維持果實內ABTS自由基清除能力影響不顯著。

圖7 20和2 ℃貯藏條件下H2S對草莓ABTS自由基清除能力的影響

3 討論與結論

目前對H2S參與調控果蔬貯藏保鮮大多處于試驗階段,主要原因是H2S自身具有毒性,且還沒被任何一個國家作為食品添加劑應用于食品加工中。因此,品嘗H2S處理的果實具有一定的風險性。但是,植物體中也能合成內源H2S,參與脫落酸(ABA)和過氧化氫(H2O2)信號轉導、影響氣孔關閉、促進種子萌發和植物根系發育、提高抗旱及金屬脅迫能力、增強植物體抗病能力[13]。隨著對H2S不斷深入研究,研發高效、經濟、無毒的H2S供體或相關衍生物產品對果蔬保鮮具有主要意義。

綜上所述,在常溫20 ℃和低溫2 ℃貯藏條件下,NaHS均能延緩果實衰老、轉色和質膜過氧化發生。在20 ℃貯藏條件下,只有當NaHS處理濃度高于0.4 mmol/L時,果實中TP含量才能顯著增加(p<0.05),同時果實具有較高的ORAC、DPPH自由基清除力、FRAP以及ABTS自由基清除能力。在2 ℃貯藏條件下,NaHS對果實內TP水平和ABTS自由基清除能力無影響,卻能提高果實中ORAC、DPPH自由基清除力和FRAP,尤其當NaHS處理濃度在1.6～3.2 mmol/L時效果明顯。