86份酸棗種質資源篩選和遺傳多樣性分析

李世鵬 陳葉 郭明欣 田珊 劉紅霞 趙旭升

摘要 [目的]綜合酸棗種質資源主要農藝性狀評價和遺傳多樣性分析結果，篩選優良酸棗種質資源。[方法]對86份酸棗種質資源的15個農藝性狀進行表型鑒定，并利用9個ISSR標記進行遺傳多樣性分析。[結果]通過對15個農藝性狀綜合評價，從86份酸棗種質資源中篩選出5份優良種質資源。9對ISSR引物共擴增出20條多態性條帶，多態性信息量（polymorphism information content，PIC）為0.60～0.81，平均值為0.70。在遺傳系數0.57的水平上86份酸棗種質資源被分為兩大類，其中79份種質資源聚為A類，7份種質資源聚為B類。[結論]該研究為酸棗種質資源分類、鑒定和新品種選育等提供理論依據。

關鍵詞 酸棗;農藝性狀;ISSR標記;遺傳多樣性

中圖分類號 S603文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0051-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective] The main agronomic traits and genetic diversity analysis results were studied to screen the excellent sour jujube germplasm resources.[Method] 15 agronomic traits of 86 sour jujube germplasm resources were identified，and 9 intersimple sequence repeat （ISSR） primers were used for genetic diversity analysis.[Result] Through the comprehensive evaluation of 15 agronomic traits，5 excellent germplasm resources were selected from 86 sour jujube individuals.A total of 20 polymorphic bands were amplified by 9 ISSR primers.The polymorphism information content （PIC） ranged from 0.60 to 0.81 with an average of 0.70.Clustering analysis showed that the 86 sour jujube germplasm resources could be divided into 2 groups at the genetic similarity coefficient of 0.57，79 sour jujube individuals were grouped into class A and 7 sour jujube individuals were grouped into class B.[Conclusion] This study provides a useful basis for the classification，identification and variety selection of sour jujube germplasm resources.

Key words Sour jujube;Agronomic traits;ISSR;Genetic diversity

基金項目 河南省自然科學基金項目（162300410198）;河南省科技開放合作計劃項目（172106000049）。

作者簡介 李世鵬（1986—），男，河南開封人，講師，博士，從事棗樹遺傳育種研究。*通信作者，教授，碩士，從事林木育種研究。

收稿日期 2018-12-07

酸棗（Z.acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus Mill）植物，原產于我國，主要分布于我國北方各省，多生長于丘陵、山區[1-2]。 酸棗是栽培棗的原始野生種，具有耐旱、耐寒、耐堿等特點，是栽培棗最主要的砧木[3-5]。酸棗仁具有較高的藥用價值，味酸、性平，具有補肝寧心、鎮靜安神、斂汗、生津等功效，是一種藥食同源食品[6]。《神農本草經》中記載酸棗能夠治療“心腹寒熱，邪結氣聚，四肢酸痛濕痹”，可以起到“安五臟，輕身延年”的作用。現代藥理研究表明，酸棗仁含有皂苷、黃酮、生物堿和脂肪酸等多種活性物質[7-12]。

酸棗類型眾多，種植資源豐富。楊雷[13]對149份酸棗種質資源的生物學性狀和營養成分進行了系統分析，從中篩選出10份可用于鮮食、加工用的種質資源。孫亞強等[14]對60份酸棗資源的7個果實表型性狀和13個品質性狀進行相關性分析。結果表明，酸棗主要農藝性狀遺傳變異豐富能夠為棗樹育種提供優良的親本材料和嫁接砧木。隨著分子生物技術的發展，人們開始利用分子標記對酸棗的遺傳多樣性進行研究。張春梅[15]利用雙抑制PCR技術開發了10對酸棗SSR多態性引物，并對43份酸棗材料進行了遺傳多樣性分析。張鵬飛等[16]利用7個SSR標記對16份棗品種和17份酸棗材料的遺傳多樣性進行分析。結果表明，酸棗的遺傳多樣性高于棗，酸棗與棗之間基因交流比較頻繁。

ISSR（intersimple sequence repeat）簡單序列重復技術是一種基于微衛星序列的分子標記，以16～25 bp的重復序列作為引物擴增相鄰反向重復序列之間的區域[17]。ISSR具有操作簡便、無需預知基因組序列、引物多態性高等特點，是研究遺傳多樣性、系統發育和進化生物學的一種快速、簡單且廉價的方法[18]。棗基因組包含高密度簡單序列重復序列[19]，因此非常適合使用ISSR標記進行遺傳多樣性分析。筆者對收集的86份酸棗種質資源的單果重、可食率、果實風味等15個主要果實性狀進行分析，并利用ISSR標記進行遺傳多樣性分析，旨在為酸棗種質資源創新、新品種選育和分子標記輔助育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 86份酸棗種質資源收集于新疆、河南、山西等地區，于2016年嫁接到洛陽師范學院棗樹種質資源圃。供試材料編號為US01～86。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實性狀調查。

2017年9月下旬至10月上旬收集各供試材料脆熟期棗果用于表型性狀調查。調查果實性狀包括單果重、果實縱徑、果實橫徑、果形指數、單核重、果核縱徑、果核橫徑、果核指數和可食率9個果實品質性狀;果肉質地、粗細、風味、汁液和異味5個感官性狀。各性狀調查標準參照《棗種質資源描述規范和數據標準》[20]。

1.2.2 DNA提取與檢測。

2017年5月中旬采集各供試材料的幼嫩葉片1～2 g，采用CTAB法[21]提取基因組總DNA。用NanoDrop2000檢測DNA質量，并稀釋至50 ng/μL。

1.2.3 ISSR引物合成與分析。

根據British Columbia大學公布的100條ISSR引物，由華大基因公司合成。PCR反應體系（10 μL）：2.0 μL基因組DNA，0.4 μL引物（10 μmol/L），0.8 μL dNTP （2.5 mmol/L），1.0 μL 10×Buffer，0.2 μL Taq DNA Polymerase （Solarbio公司）和 5.6 μL ddH2O。ISSR擴增在Applied Biosystems公司2720 Thermal Cycler型PCR儀上進行。ISSR 擴增程序：94 ℃預變性 3 min，然后94 ℃變性30 s，50/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min， 35個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，在凝膠成像分析儀（BIORADGEIDOCXR+）下拍照。

1.3 數據分析

根據ISSR擴增產物在瓊脂糖凝膠上的相對位置，對多態性條帶進行記錄，分別以“1”和“0”表示同一位置條帶的有無，建立原始數據，用NTSYSpc 2.10e軟件進行聚類分析[22]。

ISSR位點的多態性信息量（polymorphism information content，PIC）按如下計算公式進行計算： PIC=1-Pi2，式中，Pi 表示第i個等位位點出現的頻率[23]。

2 結果與分析

2.1 酸棗資源果實品質性狀分析

對收集的86份酸棗資源的單果重、果實縱徑、果實橫徑、果形指數、單核重、果核縱徑、果核橫徑、果核指數和可食率9個重要果實性狀進行分析（圖1）。結果表明，單果重變異系數最高，為42.09%，變異范圍為0.99～11.37 g;單核重變異系數次之，為27.66%，變異范圍為0.19～0.87 g。可食率的變異系數最小，為491%，變異范圍為69.95%～95.00%。其他果實品質性狀的變異系數在10.81%～19.10%（表1）。

47卷11期李世鵬等 86份酸棗種質資源篩選和遺傳多樣性分析

通過分析果肉質地、粗細、風味、汁液和異味5個感官性狀對上述種質資源進行口感綜合評價。結果表明，果肉質地以致密為主，其中較致密和致密型所占比例分別為43.0%和24.4%。果肉粗細以中等為主，所占比例為62.8%。果肉汁液以中等或偏少為主，汁液較多的種質僅占3.5%。果實風味以酸、酸甜為主，風味較好的甜酸型占19.8%，未發現甜型的酸棗材料。少部分酸棗（20.9%）存在苦味或青草味等異味（表2）。

上述結果表明，酸棗種質資源遺傳變異豐富，綜合上述9個果實品質性狀和5個口感性狀，從中篩選出5份大果型、可食率高、口感好的優良種質資源（表3）。

2.2 酸棗種質資源遺傳多樣性分析

為了進一步研究酸棗種質資源的遺傳多樣性，利用ISSR標記對86份酸棗種質資源的遺傳變異和親緣關系進行研究。利用12份酸棗種質資源對100個ISSR引物進行擴增，從中篩選出25個能擴增出多態性條帶的引物（圖2）。根據擴增效果，從中選出9個多態性和重復性好的引物用于86份酸棗種質資源的分析（表4）。9個引物在86份種質中共擴增出29條帶，其中多態性條帶為20條，占總條帶數的69%。每個引物擴增出的條帶數為2～5條，平均條帶數為3.2條。每個引物具有多態性條帶2～3條，平均多態性條帶數為2.2條。各引物PIC值為060～0.81，平均值為0.70。

基于9對ISSR引物的擴增結果，對86份酸棗種質資源進行遺傳多樣性分析。由圖3可知，86份種質資源在遺傳系數0.57的水平上被分為兩大類。A類包括79份種質資源，B類包括剩余的7份種質資源。A類種質資源在遺傳系數0.62的水平上進一步被分為4個亞類：A-1包括37份種質資源，A-2包括38份種質資源，A-3和A-4分別包括3份和1份種質資源。B類種質資源在遺傳系數0.59的水平上被進一步分為2個亞類，B-1和B-2分別包括5份和2份種質資源。5份優良種質資源中US60屬于A-1亞類，US40、US51和US86屬于A-2亞類，US73屬于B-1亞類，遺傳系數在0.56～0.80。

Note：M.D2000 plus DNA Ladder

3 結論與討論

酸棗多為灌木或小喬木，抗逆性極強，且酸棗仁具有較高的藥用價值[24]。武媛林[25]對62份酸棗種質資源的果實性狀、營養成分及其種仁的生物學性狀、藥用成分含量等進行了系統分析，將酸棗分為適合于鮮食、藥用、鮮食藥用兼用3種類型。王僧虎等[26]從邢臺山區的野生酸棗資源中選育出一個優良加工制汁、藥用酸棗新品種邢州1號。邢州1號質地致密、較脆、汁液適中、味酸甜，平均單果重3.0 g，可食率81.2%。王春桐[27]從山東濟南南部山區野生酸棗資源中篩選出一個極早熟鮮食新品種‘脆酸棗。該品種肉質致密、脆、汁液多、酸甜適口，單果重6.1 g，可食率87%。張建英等[28]從野生酸棗中篩選到2個優良酸棗鮮食品種：‘藍貓1號和‘藍貓2號。2個品種單果重為4.86和4.78 g，可食率均為89%。上述研究篩選到的酸棗品種與棗樹主要栽培種相比果實較小、可食率較低[25-28]。該研究從86份酸棗種質資源中篩選出5份優良鮮食酸棗種質資源。其中，US86單果重達11.17 g，可食率為95%，這說明酸棗優良品種選育仍有較大的潛力。

酸棗分布廣泛、表型變異豐富，目前酸棗新品種的選育主要依靠形態學鑒定。利用分子標記構建酸棗種質資源的指紋圖譜有助于酸棗種質資源的鑒定。根據25個ISSR引物的擴增結果，選擇PIC值最高的4個引物JISSR11、JISSR25、JISSR43和JISSR47可以鑒定出63份酸棗種質資源。這些特異性條帶可以作為酸棗種質資源鑒定和新品種選育的分子依據。

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