基于量子點熒光探針的過氧化氫酶活性及酶量的快速測定

翟晨 王書雅 時超 黃蔚霞

摘要 [目的]提出一種基于量子點熒光探針的過氧化氫酶活性及酶量檢測方法。[方法]以谷胱甘肽（GSH）穩定的CdTe/CdS量子點為熒光探針，對過氧化氫酶活性及酶量進行定量分析。[結果]酶活性檢測基于熒光猝滅法，對熒光猝滅機理進行探討，并對試驗參數進行優化，得到反應溶液最優pH為9，量子點與過氧化氫最優反應時間為10 min。在最優條件下，對過氧化氫酶活性進行檢測，檢測范圍為0.25～12.00? U/L，過氧化氫和酶反應前后熒光差值（F1- Fn）與猝滅前熒光值（F0）的比與過氧化氫酶活性有較好的相關性（R2=0953）。酶量檢測基于競爭免疫熒光法，通過對固化時間、抗體濃度等參數的優化，獲得酶量檢測的最優模型，檢測范圍為0.04～1.40 mg/L（R2=0.964）。通過簡單的樣品前處理，對大米中的過氧化氫酶活性及酶量進行檢測，得到酶活性檢測加標回收率為92.0%～114.0%，酶量檢測加標回收率為85.0%～115.0%。[結論]該方法操作簡單、準確、靈敏，通過一次簡單的樣品前處理，獲得酶活性及酶量檢測的食品樣品提取液，為食品中過氧化氫酶活性及酶量的快速測定提供了一種新的思路。

關鍵詞 CdTe/CdS-GSH量子點;熒光探針;過氧化氫酶活性;過氧化氫酶量;快速測定

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0194-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.056

Abstract [Objective] The research aimed to propose a method for detecting catalase activity and enzyme amount based on quantum dot fluorescent probe.[Method]CdTe/CdS quantum dots stabilized by glutathione （GSH） were used as fluorescent probes to quantitatively analyze catalase activity and enzyme amount.[Result]Catalase activity quantitatively determine based on fluorescent quenching effect of CdTe/CdSGSH QDs， parameters affecting the fluorescent response were optimized， the optimal pH of the reaction solution was 9， the optimal reaction time of QDs and H2O2 was 10 min. Under the optimum conditions， the determination of catalase was in the range from 0.25 U/L to 12.00 U/L. The difference value of fluorescence intensity after reaction of H2O2 and catalase was labeled as “Fn-F1”， the fluorescent value before quenching was labeled as “F0”， the ratio of “Fn-F1” and “F0” had a good relationship （R2=0. 953） with catalase activity. This developed method was applied to detect catalase activity in rice samples， the recovery ratio was 92.0%-114.0%.Catalase amount quantitatively determine based on fluoroimmunoassay method， under the optimum conditions， the fluorescence strength of QDs had a good relationship （R2=0.964） with concentration of catalase in the range from 0.04? mg/L to 1.40? mg/L， the recovery ratio was 85.0%-115.0%.[Conclusion] The method is simple， accurate and sensitive. The food sample extract obtained by enzyme preparation and enzyme amount detection by a simple sample preparation provides a new idea for the rapid determination of catalase activity and enzyme amount in food.

Key words CdTe/CdSGSH quantum dots;Fluorescence probe;Catalase activity;Catalase amount;Rapid determination

基金項目 國家重點研發計劃（2016YFD041204）。

作者簡介 翟晨（1988—），女，山東淄博人，工程師，博士，從事食品品質與安全的快速檢測技術研究。*通信作者，高級工程師，博士，從事食品品質與安全的檢測技術研究。

收稿日期 2018-11-18

過氧化氫酶是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，是生物演化過程中建立起來的生物防御系統的關鍵酶[1-2]。通過過氧化氫酶活性的預測可以早期預警儲藏玉米是否污染AFB1[3]、優化糧食儲存條件[4-5]、監測果蔬品質劣變狀態[6]、檢測種子活性[7]等，因此準確且靈敏地預測過氧化氫酶活性具有重要意義。但預測過氧化氫酶活性需要進行酶提取，酶脫離生物組織，活性會發生一定的變化，因此結合酶量的檢測可更全面地說明生物組織內過氧化氫酶的變化規律。

測定過氧化氫酶活性的常用方法有高錳酸鉀滴定法、碘量滴定法、分光光度法和氣量法等[8]，這些方法準確度較高，但靈敏度較低，難以監測到樣品中過氧化氫酶活性的微量變化，因此需要開發一種快速、準確、靈敏的過氧化氫酶活性檢測方法。過氧化氫酶含量的檢測常用方法有熒光PCR[9]、免疫印跡法[10]、考馬斯亮藍染色法[11]等，這些方法從基因或者蛋白層面分析酶量，但存在前處理復雜、檢測時間長、特異性差等缺點。因此需要開發一種準確、靈敏，且通過一次簡單的樣品前處理，能夠快速獲得酶活性及酶量的檢測方法。

量子點是一種“準零維”的納米顆粒，具有吸收譜較寬、發光效率高以及穩定性好等優異的光學特性[12-13]。量子點的發光性能與其表面狀態密切相關，其熒光猝滅作用都是由量子點表面狀態的變化而引起的[14-15]。量子點作為新型熒光探針具有高靈敏度、快速、低檢測限的優勢[16]，近幾年在小分子快速檢測方面應用較多。筆者提出一種基于以谷胱甘肽穩定的CdTe/CdS量子點（CdTe/CdS-GSH）為熒光探針的過氧化氫酶活性及酶量檢測方法，通過一次簡單的樣品前處理，快速、靈敏地獲得樣品中的過氧化氫酶活性及酶量，為過氧化氫酶的精準檢測提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Hitachi F-7000熒光分光光度計;Hitachi U-3900分光光度計;Sartorius PB-10型pH計;Eppendorf 5415R小型高速冷凍離心機。

CdTe/CdS-GSH 量子點購買于蘇州星爍納米科技有限公司;羧基化磁性納米球購買于武漢珈源量子點技術開發有限責任公司;過氧化氫酶（2 000 U/mg）及過氧化氫酶抗體均購買于上海士鋒生物科技有限公司;過氧化氫、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）等試劑均為分析純;試驗中所用水為純水器Milli-Q reference處理的超純水。

1.2 過氧化氫酶活性檢測

在室溫下，用pH 7.4的PBS緩沖溶液制備一系列不同活性的過氧化氫酶溶液，與定量過氧化氫反應10 min后，得到反應液A。在一系列10 mL比色管中，分別加入500 μL CdTe/CdS-GSH 量子點溶液以及1 mL新鮮制備的反應液A，用緩沖溶液定容至5 mL，充分搖勻后室溫下放置一段時間進行反應。

將以上制備好的溶液潤洗并倒入10 mL四面通透的比色皿中，在325 nm激發光激發下，測定并記錄586 nm處熒光強度F，激發、發射狹縫寬度均是5 nm。

1.3 過氧化氫酶量檢測

1.3.1 過氧化氫酶抗體-磁性粒子復合物。25 mg/mL的磁性粒子中加入6 mg/mL EDC和4 mg/mL NHS PBS緩沖溶液（pH 6.0），室溫下振蕩反應30 min，磁分離，PBS溶液洗滌3次后加入5 μL過氧化氫酶抗體（pH 7.4），在37 ℃下振蕩孵育2 h，磁分離，洗滌3次除去未結合的抗體，得到過氧化氫酶抗體-磁性粒子復合物。

1.3.2

過氧化氫酶-量子點復合物。取CdTe/CdS-GSH 量子點溶液150 μL，經EDC和NHS室溫下活化15 min，加入過氧化氫酶溶液（pH 7.4），置于37 ℃搖床上2 h，加入10 g/L牛血清白蛋白（BSA）溶液以封閉量子點上未反應的羧基位點，將偶聯反應所得到的溶液放置于4 ℃過夜保存。

將已知濃度的過氧化氫酶溶液與10 μL過氧化氫酶抗體-磁性粒子復合物在37 ℃下振蕩反應30 min，磁分離，用pH 7.4 PBS溶液洗滌3次后，用PBS溶液定容至1 mL，加入過氧化氫酶-量子點復合物，37 ℃下振蕩反應30 min，磁分離，洗滌3次，去除多余的過氧化氫酶-量子點復合物，將該溶液進行熒光掃描，在325 nm激發光激發下，測定并記錄586 nm處熒光強度F，激發、發射狹縫寬度均是5 nm。

1.4 酶活性及酶量檢測原理

過氧化氫導致CdTe/CdS-GSH 量子點熒光猝滅，猝滅前（F0）后（Fn）的熒光比值（Fn/F0）與過氧化氫的濃度呈負相關。過氧化氫酶活性越強，底物過氧化氫被分解的越多，熒光猝滅程度越小，過氧化氫與酶反應前（F1）后（Fn）的熒光差值與熒光猝滅前（F0）熒光值的比為[（Fn- F1）/ F0]，該值與過氧化氫酶活性建立數學關系。

通過酰胺反應，分別制備過氧化氫酶抗體-磁性粒子復合物、過氧化氫酶-量子點復合物。樣品中的酶通過免疫反應首先與過氧化氫酶抗體-磁性粒子結合，過氧化氫酶-量子點復合物再與過氧化氫酶抗體-磁性粒子復合物混合，使抗體中剩余的結合位點通過與過氧化氫酶將CdTe/CdS-GSH量子點結合到磁性粒子上，通過磁鐵吸附，除去未結合的量子點。通過量子點的熒光強度，判斷抗體與樣品中酶反應后剩余的結合位點數，進而得到樣品中過氧化氫酶量。酶活性及酶量檢測原理如圖1所示。

1.5 加標回收試驗

為了驗證該方法是否可以應用于實際樣品中微量過氧化氫酶活性及含量的檢測，以大米為研究對象，進行加標回收試驗。將大米放置于烘箱中，在100 ℃環境下過夜，使樣品中的過氧化氫酶滅活。將加熱處理過的大米打碎并充分研磨，研磨后將大米分成均勻的小份，每小份添加不同量的過氧化氫酶（微量，樣品總質量增加可忽略），在冰水浴下再次進行充分研磨后將每份樣品加入5 mL pH 7.4 PBS緩沖溶液，充分搖勻，在0 ℃下6 000 r/min離心20 min，取上清液按照“1.2”及“1.3”方法進行過氧化氫酶活性及酶量檢測[5，17]。

2 結果與分析

2.1 基于量子點猝滅的酶活性檢測

2.1.1 猝滅機理探討。

采集過氧化氫猝滅量子點前后的熒光光譜，并進行分析，從325 nm激發光激發下的波長掃描光譜圖（圖2a）可看出，隨著過氧化氫濃度增大，熒光峰強度越來越小，且逐漸藍移，當熒光強度降至原來的50%時，波長藍移約8 nm。推測原因是過氧化氫具有強氧化性，能夠氧化量子點導致表面產生新的缺陷，量子點的有效尺寸減少，且增加了非輻射方式的電子躍遷，減少了量子點本身的電子-空穴直接復合，即減小了激子態熒光的產生，從而導致熒光猝滅[18-19]。從量子點與過氧化氫反應前后的紫外-可見吸收光譜（圖2b）可以看出，CdTe/CdS-GSH 量子點的吸收峰在538 nm處，過氧化氫在350～650 nm處無明顯吸收峰，過氧化氫與量子點反應后，吸收峰藍移且峰值逐漸降低，當過氧化氫濃度較高時，該吸收峰基本消失，這是由于量子點表面缺陷導致熒光物質吸收光譜發生改變。從圖2a中插圖的熒光猝滅的Stern-Volmer曲線可以看出，F0/F值隨著過氧化氫濃度增大而逐漸增大，但是該增長曲線非直線，說明量子點的熒光猝滅是通過復雜的多元作用實現的[20]。

2.1.2 檢測參數優化。

反應溶液pH、量子點與過氧化氫反應時間等條件影響方法的靈敏度。如圖3a所示，量子點猝滅前，在酸性環境下熒光值較低，隨著pH增加熒光值逐漸增高，在pH為9.0左右時熒光值最高。量子點與一定濃度的過氧化氫溶液反應后，相比猝滅前，熒光強度有明顯下降，由圖3a可見，當pH為9.0時該比值最小，即該pH時，量子點由過氧化氫的氧化而造成的猝滅最敏感，進而對過氧化氫的濃度變化也最靈敏，綜上所述，試驗的緩沖溶液選取pH為9.0的磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩沖溶液。

過氧化氫氧化量子點，導致量子點熒光猝滅，該氧化時間是否影響猝滅效果需要進行探討，從圖3b可看出，量子點與不同濃度的過氧化氫（Ⅰ，濃度較低;Ⅱ，濃度較高）反應，熒光值均迅速下降，過氧化氫濃度較高時，單位時間內下降幅度較大，當反應時間超過10 min后，無論過氧化氫濃度高低，量子點熒光值基本恒定，該現象可能是過氧化氫氧化量子點達到飽和導致，因此量子點與過氧化氫的最優反應時間為10 min。

2.1.3 預測模型建立。

在優化的試驗條件下，過氧化氫的加入使量子點熒光猝滅，當量子點與不同濃度的過氧化氫反應，猝滅值也有較大的差異。過氧化氫在過氧化氫酶的催化下，快速分解為水和氧氣，相同時間下，過氧化氫溶液分別與不同活性的過氧化氫酶混合后，活性較高的酶催化分解的過氧化氫分子相對較多，將該混合溶液與量子點溶液反應，由于導致量子點熒光猝滅的過氧化氫分子較少，因此熒光的猝滅程度較低，反之，熒光的猝滅程度較高，如圖4所示，酶活性在0.25～12.00 U/L，隨著活性的增加，猝滅后的熒光值（Fn）越高，將過氧化氫與酶反應前（F1）后（Fn）的熒光值與熒光猝滅前（F0）的熒光值的比[（Fn - F1）/F0]與過氧化氫酶的活性進行相關性分析，得到決定系數R2為0.953（圖5），說明可以采用該方法對過氧化氫酶活性進行快速、準確且靈敏的預測。

2.2 基于量子點免疫熒光的酶量檢測

2.2.1 檢測參數優化。

制備過氧化氫酶抗體-磁性粒子復合物時，抗體與磁珠的固化時間影響所制備的復合物數量，導致可結合的酶量相應減少，進而影響檢測效果。固化時間分別設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，隨著固化時間的增加，熒光強度逐漸增強，當固化時間大于2 h時，熒光強度趨于穩定，因此過氧化氫酶抗體與磁性粒子的最優固化時間為2 h。抗體的濃度也對檢測結果有重要的影響，抗體過少導致該復合物制備數量減少，過多導致抗體浪費，經優化，抗體的濃度為125 μg/mL。

制備過氧化氫酶-量子點復合物時，緩沖溶液濃度、過氧化氫酶濃度及反應時間等參數關系該復合物制備效果，對以

上試驗條件進行優化，最優條件如下：緩沖溶液濃度為1 mmol/L，添加過氧化氫酶量為20 μL，反應時間為2 h。

2.2.2 模型建立。

樣品中的過氧化氫酶較多時，導致帶有量子點的過氧化氫酶較少地與磁性粒子結合，熒光強度較弱，因此過氧化氫酶量與熒光強度呈負相關，如圖6a所示，隨著過氧化氫酶量的增加，熒光強度逐漸下降，由于磁納米粒子的影響，熒光光譜基線漂移，導致直接定量困難，因此對光譜進行基線校準，校準結果見圖6b，采用自適應迭代重加權懲罰最小二乘法（adaptive iteratively reweighted Penalized Least Squares，airPLS），可在保留有用光譜信息的基礎上，對基線進行準確校準。對校準后的熒光光譜進行定量分析，隨著酶量增加，熒光峰值逐漸下降，在0.04～1.40 mg/L酶量與熒光峰值呈線性關系，如圖7建立預測模型，酶量與峰值具有較好的相關性（R2=0.964）。此結果說明該方法具有較高的準確度。

2.3 實際樣品的檢測

將滅活的大米打磨后分成均勻小份，分別加入不同量的過氧化氫酶，按照該研究開發的試驗方法測得酶活性及酶量，結果見表1～2，酶活性檢測加標回收率為92.0%～114.0%，酶量檢測加標回收率為85.0%～115.0%，說明該方法檢測實際樣品具有可行性。

3 結論

該研究以谷胱甘肽（GSH）穩定的CdTe/CdS量子點為熒光探針，對過氧化氫酶活性及酶量進行定量分析，在最優條件下，基于熒光猝滅機理建立了酶活為0.25～12.00 U/L的預測操作簡單、準確、靈敏，通過一次簡單的樣品前處理，得到酶活性及酶量檢測的樣品提取液，為食品中過氧化氫酶活性及酶量的快速、靈敏測定提供了一種新的思路。