DNA條形碼在本溪洋湖溝水生昆蟲(chóng)鑒定中的應(yīng)用

于丹 王劍峰 劉玉雙 王京

摘要 [目的]通過(guò)調(diào)查本溪市洋湖溝水生昆蟲(chóng)的種類，評(píng)價(jià)洋湖溝地區(qū)太子河源頭的水質(zhì)情況。[方法]2017年7月對(duì)洋湖溝水生昆蟲(chóng)進(jìn)行了采集，基于EPT豐富度、采用DNA條形碼及形態(tài)學(xué)特征對(duì)洋湖溝所采水生昆蟲(chóng)進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]共得到11個(gè)種14條樣品序列，其隸屬于3目11科：蜉蝣目3種，襀翅目4種，毛翅目4種。[結(jié)論]鑒定結(jié)果顯示，洋湖溝地區(qū)EPT水生昆蟲(chóng)種類較多，水質(zhì)清潔，達(dá)到國(guó)家I類標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞 洋湖溝;水生昆蟲(chóng);EPT;DNA條形碼;水質(zhì)

中圖分類號(hào) S186文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）11-0056-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.018

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]In order to investigate the species of aquatic insects in Yanghugou， Benxi， evaluate the water quality of the source of the Taizi River in Yanghugou area. [Method]Aquatic insects of Yanghugou were collected in July 2017. Based on the EPT richness， DNA barcode method and morphological features， the aquatic insects collected in Yanghugou were identified. [Result]A total of 14 sequences were obtained， totaling 11 species， belonging to 3 orders and 11 families. Among them， there are 3 species of the Ephemeroptera; 4 species of the Plecoptera; and 4 species of the Trichoptera. [Conclusion]The identification results show that there are many aquatic insects in the Yanghugou area， and the water quality is clean. It has reached the national class I standard.

Key words Yanghugou;Aquatic insects;EPT;DNA barcode;Water quality

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672332）;遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201602525）。

作者簡(jiǎn)介 于丹（1995—），女，遼寧錦州人，碩士研究生，研究方向：昆蟲(chóng)DNA分類。*通信作者，副教授，博士，從事昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)與形態(tài)學(xué)研究。

鳴謝 感謝揚(yáng)州大學(xué)霍慶波博士對(duì)襀翅目昆蟲(chóng)鑒定提供的幫助。

收稿日期 2019-03-22

洋湖溝村位于遼寧省本溪滿族自治縣與桓仁縣交匯處，屬長(zhǎng)白山余脈的丘陵地帶，太子河發(fā)源于此地，流經(jīng)遼陽(yáng)、鞍山市[1]。洋湖溝村森林植被茂密，物種豐富，至今還保存著原始次生林，作為源頭水，其地表水質(zhì)應(yīng)該達(dá)到國(guó)家I類標(biāo)準(zhǔn)[2]。

生物評(píng)價(jià)方法已經(jīng)成為評(píng)價(jià)水體質(zhì)量的一個(gè)新方向，對(duì)水體環(huán)境質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)的主要方法有指示生物、各種生物指數(shù)和多樣性指數(shù)[3]，可用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)的水生昆蟲(chóng)指示生物有100多種，其中應(yīng)用較為廣泛的是分析鑒定底棲動(dòng)物中3個(gè)敏感性的水生昆蟲(chóng)類群種類，即蜉蝣目（Ephemeriptera）、襀翅目（Plecoptera）和毛翅目（Trichoptera）的種類（簡(jiǎn)稱EPT）及數(shù)量情況，利用EPT豐富度可快速評(píng)價(jià)水質(zhì)優(yōu)劣[4]。

三種EPT昆蟲(chóng)的成蟲(chóng)和稚蟲(chóng)在形態(tài)學(xué)存在較大差異，準(zhǔn)確快速的鑒定存在較大困難。DNA條形碼技術(shù)自2003年提出以來(lái)[5-6]，已被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)的分子鑒定[7-8]。因此，此次調(diào)查旨在結(jié)合DNA條形碼和形態(tài)學(xué)特征，鑒別洋湖溝村太子河源頭水域中EPT水生昆蟲(chóng)種類豐富度，從而評(píng)價(jià)洋湖溝地區(qū)的水質(zhì)情況[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

水生昆蟲(chóng)樣品，2017年7月采集于遼寧省本溪縣洋湖溝村太子河支流，采用手抄網(wǎng)的方法進(jìn)行采集，標(biāo)本于80%乙醇中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

根據(jù)蟲(chóng)體大小的不同，采用無(wú)損傷凍融法與粉碎法2種方法進(jìn)行蟲(chóng)體總DNA的提取。蟲(chóng)體大于2 cm采用組織粉碎法（一只足）提取;蟲(chóng)體小于2 cm的采用無(wú)損傷凍融法提取。選取DNA條形碼引物：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[9]。30 μL反應(yīng)體系：ddH2O 21.25 μL，10 ×Taq Buffer 300 μL，dNTP 2.40 μL，上、下游引物各0.60 μL，Taq DNA Polymerase 0.15 μL（5 U/L），DNA模板2.00 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 30 s，退火40～45 ℃ 1min，延伸72 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);終延伸72 ℃ 7 min;最終保存于4 ℃。取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1% 瓊脂糖膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。將得到的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序公司，自帶引物進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。

1.3 測(cè)序結(jié)果的分析

用Chromas軟件觀看測(cè)序結(jié)果是否可用;用Seqman軟件對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，用Mega 7.0軟件進(jìn)行切齊。將切齊后的序列保存成一個(gè)TXT文本，采用 ClustalX 1.83軟件對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。將其比對(duì)結(jié)果轉(zhuǎn)換成Mega格式，最后用Mega 7.0軟件，基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型，構(gòu)建近鄰結(jié)合樹(shù)（Neighbour-Joining Tree，NJ樹(shù)）[10]。

1.4 形態(tài)拍照

水生昆蟲(chóng)標(biāo)本拍照采用Leica M205C體視顯微鏡。

1.5 物種鑒別

1.5.1

DNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)：將拼接得到的堿基序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）、EMBL（The European Molecular Biology Laboratory）、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、Bold systems V4數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，初步確定物種名稱。

1.5.1

形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)初步比對(duì)，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒別[11-18]，確定昆蟲(chóng)種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

共提取水生昆蟲(chóng)30頭（包含相同種），經(jīng)分子試驗(yàn)，有部分樣品DNA提取及PCR未成功，共送樣測(cè)序14個(gè)樣品，得到14條序列，11個(gè)種。有12條序列長(zhǎng)度為658 bp，其余2條為657、659 bp。

2.2 基于COI序列構(gòu)建的NJ樹(shù)

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)、構(gòu)建近鄰結(jié)合樹(shù)（NJ樹(shù)）如圖1，相似度較高即親緣關(guān)系較近的種聚在一起，證明鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 物種鑒別

所得序列經(jīng)比對(duì)，有些種類比對(duì)結(jié)果相似度較低，比對(duì)結(jié)果及相似度等信息見(jiàn)表1，并結(jié)合形態(tài)鑒定，共得水生昆蟲(chóng)11種，其中蜉蝣目3種，襀翅目4種，毛翅目4種，見(jiàn)圖2～13。

3 結(jié)論

此研究結(jié)合DNA條形碼和形態(tài)學(xué)方法，對(duì)洋湖溝所采集的水生昆蟲(chóng)進(jìn)行鑒別并統(tǒng)計(jì)，共得到EPT昆蟲(chóng)11種，其隸屬于3目11科：其中蜉蝣目3種，襀翅目4種，毛翅目有4種。EPT昆蟲(chóng)為敏感性水生昆蟲(chóng)，考慮到采集地區(qū)、采集季節(jié)及不同地區(qū)分類標(biāo)準(zhǔn)不同等因素，依據(jù)EPT種類豐富度評(píng)價(jià)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[19-21]，可以得出遼寧省洋湖溝村太子河源頭水質(zhì)清潔，達(dá)到國(guó)家I類標(biāo)準(zhǔn)。

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