DNA條形碼在本溪洋湖溝水生昆蟲鑒定中的應用

于丹 王劍峰 劉玉雙 王京

摘要 [目的]通過調查本溪市洋湖溝水生昆蟲的種類，評價洋湖溝地區太子河源頭的水質情況。[方法]2017年7月對洋湖溝水生昆蟲進行了采集，基于EPT豐富度、采用DNA條形碼及形態學特征對洋湖溝所采水生昆蟲進行鑒定。[結果]共得到11個種14條樣品序列，其隸屬于3目11科：蜉蝣目3種，襀翅目4種，毛翅目4種。[結論]鑒定結果顯示，洋湖溝地區EPT水生昆蟲種類較多，水質清潔，達到國家I類標準。

關鍵詞 洋湖溝;水生昆蟲;EPT;DNA條形碼;水質

中圖分類號 S186文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0056-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.018

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]In order to investigate the species of aquatic insects in Yanghugou， Benxi， evaluate the water quality of the source of the Taizi River in Yanghugou area. [Method]Aquatic insects of Yanghugou were collected in July 2017. Based on the EPT richness， DNA barcode method and morphological features， the aquatic insects collected in Yanghugou were identified. [Result]A total of 14 sequences were obtained， totaling 11 species， belonging to 3 orders and 11 families. Among them， there are 3 species of the Ephemeroptera; 4 species of the Plecoptera; and 4 species of the Trichoptera. [Conclusion]The identification results show that there are many aquatic insects in the Yanghugou area， and the water quality is clean. It has reached the national class I standard.

Key words Yanghugou;Aquatic insects;EPT;DNA barcode;Water quality

基金項目 國家自然科學基金項目（31672332）;遼寧省自然科學基金項目（201602525）。

作者簡介 于丹（1995—），女，遼寧錦州人，碩士研究生，研究方向：昆蟲DNA分類。*通信作者，副教授，博士，從事昆蟲分子系統學與形態學研究。

鳴謝 感謝揚州大學霍慶波博士對襀翅目昆蟲鑒定提供的幫助。

收稿日期 2019-03-22

洋湖溝村位于遼寧省本溪滿族自治縣與桓仁縣交匯處，屬長白山余脈的丘陵地帶，太子河發源于此地，流經遼陽、鞍山市[1]。洋湖溝村森林植被茂密，物種豐富，至今還保存著原始次生林，作為源頭水，其地表水質應該達到國家I類標準[2]。

生物評價方法已經成為評價水體質量的一個新方向，對水體環境質量進行評價的主要方法有指示生物、各種生物指數和多樣性指數[3]，可用于水質監測的水生昆蟲指示生物有100多種，其中應用較為廣泛的是分析鑒定底棲動物中3個敏感性的水生昆蟲類群種類，即蜉蝣目（Ephemeriptera）、襀翅目（Plecoptera）和毛翅目（Trichoptera）的種類（簡稱EPT）及數量情況，利用EPT豐富度可快速評價水質優劣[4]。

三種EPT昆蟲的成蟲和稚蟲在形態學存在較大差異，準確快速的鑒定存在較大困難。DNA條形碼技術自2003年提出以來[5-6]，已被廣泛應用于昆蟲的分子鑒定[7-8]。因此，此次調查旨在結合DNA條形碼和形態學特征，鑒別洋湖溝村太子河源頭水域中EPT水生昆蟲種類豐富度，從而評價洋湖溝地區的水質情況[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

水生昆蟲樣品，2017年7月采集于遼寧省本溪縣洋湖溝村太子河支流，采用手抄網的方法進行采集，標本于80%乙醇中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴增與測序

根據蟲體大小的不同，采用無損傷凍融法與粉碎法2種方法進行蟲體總DNA的提取。蟲體大于2 cm采用組織粉碎法（一只足）提取;蟲體小于2 cm的采用無損傷凍融法提取。選取DNA條形碼引物：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[9]。30 μL反應體系：ddH2O 21.25 μL，10 ×Taq Buffer 300 μL，dNTP 2.40 μL，上、下游引物各0.60 μL，Taq DNA Polymerase 0.15 μL（5 U/L），DNA模板2.00 μL。反應條件：預變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 30 s，退火40～45 ℃ 1min，延伸72 ℃ 1 min，進行40個循環;終延伸72 ℃ 7 min;最終保存于4 ℃。取5 μL PCR產物，采用1% 瓊脂糖膠電泳檢驗擴增效果。將得到的PCR產物送至上海生工測序公司，自帶引物進行純化和雙向測序。

1.3 測序結果的分析

用Chromas軟件觀看測序結果是否可用;用Seqman軟件對雙向測序結果進行拼接，用Mega 7.0軟件進行切齊。將切齊后的序列保存成一個TXT文本，采用 ClustalX 1.83軟件對基因序列進行比對分析。將其比對結果轉換成Mega格式，最后用Mega 7.0軟件，基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型，構建近鄰結合樹（Neighbour-Joining Tree，NJ樹）[10]。

1.4 形態拍照

水生昆蟲標本拍照采用Leica M205C體視顯微鏡。

1.5 物種鑒別

1.5.1

DNA數據庫比對：將拼接得到的堿基序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）、EMBL（The European Molecular Biology Laboratory）、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、Bold systems V4數據庫上進行比對，初步確定物種名稱。

1.5.1

形態學鑒定。經DNA數據庫初步比對，同時結合形態學鑒別[11-18]，確定昆蟲種類。

2 結果與分析

2.1 測序結果

共提取水生昆蟲30頭（包含相同種），經分子試驗，有部分樣品DNA提取及PCR未成功，共送樣測序14個樣品，得到14條序列，11個種。有12條序列長度為658 bp，其余2條為657、659 bp。

2.2 基于COI序列構建的NJ樹

測序結果經過Blast比對、構建近鄰結合樹（NJ樹）如圖1，相似度較高即親緣關系較近的種聚在一起，證明鑒定結果的準確性。

2.3 物種鑒別

所得序列經比對，有些種類比對結果相似度較低，比對結果及相似度等信息見表1，并結合形態鑒定，共得水生昆蟲11種，其中蜉蝣目3種，襀翅目4種，毛翅目4種，見圖2～13。

3 結論

此研究結合DNA條形碼和形態學方法，對洋湖溝所采集的水生昆蟲進行鑒別并統計，共得到EPT昆蟲11種，其隸屬于3目11科：其中蜉蝣目3種，襀翅目4種，毛翅目有4種。EPT昆蟲為敏感性水生昆蟲，考慮到采集地區、采集季節及不同地區分類標準不同等因素，依據EPT種類豐富度評價水質標準[19-21]，可以得出遼寧省洋湖溝村太子河源頭水質清潔，達到國家I類標準。

參考文獻

[1] 渠曉東，張遠，馬淑芹，等.太子河流域大型底棲動物群落結構空間分布特征[J].環境科學研究，2013，26（5）：509-515.

[2] 中國環境科學研究院.地表水環境質量標準：GB 3838—2002[S].北京：中國環境科學出版社，2002：3-4.

[3] 劉敬澤.監測水環境變化的大無脊椎動物[J].生物學通報，1999，34（1）：35.

[4] 陳麗，丁建東.EPT指數在水污染監測方面的應用[J].南通大學學報（自然科學版），2005，4（3）：26-28.

[5] HEBERT P D N，CYWINSKA A，BALL S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the royal society B：Biological sciences，2003，270（1512）：313-321.

[6] HEBERT P D N，RATNASINGHAM S，DE WAARD J R.Barcoding animal life：Cytochrome c oxidase subunit I divergences among closely related species[J].Proceedings of the royal society B：Biological sciences，2003，270（S1）：96-99.

[7] VOGLER A P，DESALLE R，ASSMANN T，et al.Molecular population genetics of the endangered tiger beetle Cicindela dorsalis（Coleoptera：Cicindelidae）[J].Annals entomological society of America，1993，86（2）：142-152.

[8] KIM I，CHA S Y，YOON M H，et al.The complete nucleotide sequence and gene organization of the mitochondrial genome of the oriental mole cricket，Gryllotalpa orientali（Orthoptera：Gryllotalpidae）[J].Gene，2005，353（2）：155-168.

[9] FOLMER O，BLACK M，HOEH W，et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Molcular marine biology and biotechnology，1994，3（5）：294-299.

[10] SAITOU N，NEI M.The neighbourjoining method：A new method for reconstruction phylogenetic trees[J].Molecular biology and evolution，1987，4：406-425.

[11] 王玉玉.大別山越南蜉Vietnamella dabieshanensis和桶形贊蜉Paegniodes cupulatus線粒體基因組序列的測定（昆蟲綱：蜉蝣目）[D].南京：南京師范大學，2011：10-18.

[12] 李姍.河南省襀科稚蟲分類研究[D].新鄉：河南科技學院，2015：29-31.

[13] 王志杰.中國叉襀科的分類研究（襀翅目：叉襀總科）[D].揚州：揚州大學，2007：68-87.

[14] 徐繼華.中國角石蛾科分類及其成幼蟲聯系研究（昆蟲綱：毛翅目）[D].南京：南京農業大學，2014：1-2，9-26.

[15] 冷科明，楊蓮芳，王建國，等.江西省毛翅目昆蟲名錄[J].江西植保，2000，23（1）：12-16.

[16] 周長發，歸鴻，周開亞.中國蜉蝣目稚蟲科檢索表（昆蟲綱）[J].南京師大學報（自然科學版），2003，26（2）：65-68.

[17] 周長發，歸鴻，周開亞.中國蜉蝣目成蟲科檢索表（昆蟲綱）[J].南京師大學報（自然科學版），2003，26（3）：57-60.

[18] 肖利鳳.新疆北部地區蜉蝣目昆蟲種類及多樣性研究[D].石河子：石河子大學，2014：14-19.

[19] 童曉立，胡慧建，陳思源.利用水生昆蟲評價南昆山溪流的水質[J].華南農業大學學報，1995，16（3）：6-10.

[20] 楊蓮芳，李佑文，戚道光，等.九華河水生昆蟲群落結構和水質生物評價[J].生態學報，1992，12（1）：8-15.

[21] 王備新，楊蓮芳.我國東部底棲無脊椎動物主要分類單元耐污值[J].生態學報，2004，24（12）：2768-2775.