小麥麩皮酸解液脫毒發酵制備蘋果酸的可行性

郭娜 謝賓 劉興運

摘要 [目的]研究小麥麩皮酸解液中糠醛和5-羥甲基糠醛經活性炭吸附脫除處理及脫除后進行發酵制備蘋果酸的可行性。[方法]通過添加不同濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛，研究其對曲霉發酵生產蘋果酸的影響;采用活性炭吸附方法，研究其對小麥麩皮酸解液中糠醛、5-羥甲基糠醛的脫除效果，并對脫毒后小麥麩皮酸解液進行曲霉發酵生產蘋果酸。[結果]使用活性炭對小麥麩皮酸解液進行脫毒處理，最適條件為活性炭含量1.5%、處理溫度30 ℃、時間40 min;在此條件下，小麥麩皮酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛的脫除率分別達63.87%和61.49%。脫毒后的小麥麩皮酸解液可以作為發酵生產蘋果酸的碳源，含有的糠醛與5-羥甲基糠醛含量顯著減少。[結論]經活性炭處理后的小麥麩皮酸解液作為碳源進行發酵生產蘋果酸是可行的。

關鍵詞 小麥麩皮;酸解液;脫毒;活性炭;糠醛;5-羥甲基糠醛;蘋果酸

中圖分類號 TS210.9文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0169-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.048

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to study the feasibility of fermentation of furfural and 5HMF in wheat bran acid hydrolysate by adsorption and removal of activated carbon to prepare malic acid.[Method]The effects of fermentation on the production of malic acid by Aspergillus were studied by adding different concentrations of furfural and 5HMF.The activated carbon adsorption method was used to study the removal effect of furfural and 5HMF in wheat bran acid hydrolysate， and the malic acid fermentation of wheat bran acid hydrolysate was carried out to produce malic acid.[Result]The activated carbon was used to detoxify wheat bran acid hydrolysate.The optimum conditions were 1.5% activated carbon content， 30 °C treatment temperature and 40 min time. Under these conditions， the removal rates of furfural and 5hydroxymethylfurfural in wheat bran acid hydrolysate were 63.87% and 61.49%， respectively.The detoxified wheat bran acid hydrolysate could be used as a carbon source for the production of malic acid by fermentation， and the content of furfural and 5hydroxymethylfurfural was significantly reduced.

Key words Wheat bran;Acidolysis solution;Detoxification;Activated carbon;Furfural;5HMF;Malic acid

基金項目 合肥師范學院人才科研啟動基金項目（2014rcjj06）。

作者簡介 郭娜（1984—），女，安徽蚌埠人，講師，博士，從事食品科學研究。

收稿日期 2018-11-08

L-蘋果酸是一種天然有機酸，因其口感與蘋果酸味接近，是一種優良的酸味劑，被廣泛應用于高檔飲料與食品行業;其在醫藥上有著重要的作用，用于治療肝功能不全、肝衰竭和貧血等疾病[1-2]。目前依靠糧食作為原料發酵生產蘋果酸，隨著市場對其需求量的日益增大，采用非糧資源生產蘋果酸成為一種勢在必行的可行途徑。小麥麩皮是面粉副產物，富含纖維素、半纖維素等成分，在高溫條件下進行酸解，可降解生成葡萄糖、木糖等碳水化合物，且酸解糖化率比較理想[3-4]，降解生成的碳水化合物可作為發酵生產L-蘋果酸的原料，是一條增加蘋果酸的生產原料、降低生產成本的可持續發展途徑。

研究表明，纖維素稀酸水解產物含有的呋喃衍生物、酚類，如糠醛、5-羧甲基糠醛（5-HMF）是后期發酵菌種生長和發酵的主要抑制物，必須經過處理才能利用[5-6]。Cavka等[7]利用硼氫化鈉在20 ℃和pH 6.0的條件下處理云杉木質纖維水解物，有效地降低了抑制物（對苯醌、2，6-二甲氧基苯醌和糠醛等）的含量，使生物乙醇的產率從0.02 g/g提高至0.30 g/g。Chen等[8]通過真空旋轉蒸發法脫毒，脫毒效果良好，其中可揮發性呋喃的脫除率達98%。Lee等[9]通過電化學聚合方法去除木質纖維素中的酚類化合物，有效地脫除了稻草水解產物中的酚類物質，達到降低抑制作用的效果。李志強等[10]利用石墨化碳對竹材稀酸預處理液中的發酵抑制物進行脫除效果研究，結果表明石墨化碳能夠有效脫除發酵抑制物，脫除率達99%，脫毒后的預處理液可用于乙醇發酵。

筆者通過添加不同濃度的糖醛、5-羥甲基糠醛，研究其對曲霉發酵生產蘋果酸的影響;采用活性炭吸附方法，研究其對小麥麩皮酸解液中糠醛、5-羥甲基糠醛的脫除效果，并對脫毒后小麥麩皮酸解液進行曲霉發酵生產蘋果酸，探究小麥麩皮酸解液作為碳源發酵生產蘋果酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 試材

小麥麩皮（合肥市場購買）;寄生曲霉（CICC40365）;5-羥甲基糠醛、糠醛等試劑均為分析純。

1.2 設備

氣浴恒穩振蕩器722S，上海精密科學儀器有限公司;紫外分光光度計UV762，上海精密科學儀器有限公司;電子分析天平FA1604，上海衡平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 小麥麩皮酸解液的制備。

小麥麩皮經粉碎并過60目篩后，于50 ℃烘箱烘干后室溫密閉保存。對上述處理后的小麥麩皮進行酸解：硫酸濃度為1.5%，小麥麩皮67 g/L，100 ℃下酸解3 h。取出并自然降溫后過濾，濾液經NaOH調節至pH中性，即為酸解液，用于后續試驗。

1.3.2 糠醛、5-羥甲基糠醛含量的測定[11]。

準確稱取1000 g糠醛和1.000 g 5-羥甲基糠醛，分別用95%乙醇溶解并稀釋至不同濃度梯度。采用紫外分光光度計分別在276和284 nm處測定糠醛和5-羥甲基糠醛吸光度（OD276和OD284），建立標準曲線回歸方程。結果表明，糠醛濃度在0.10～10.00 mg/L、5-羥甲基糠醛濃度在1.00～18.00 mg/L與吸光度具有良好的線性關系，線性方程分別為

Y1=0.189 9X1-0016 3（R2=0.996 6）、Y2=0.123 6X2+0.024 9（R2=0.996 9），其中Y1、Y2為吸光度，X1、X2分別為糠醛、5-羥甲基糠醛的濃度。

制備得到的小麥麩皮酸解液在3 000 r/min下離心10 min，取上清液分別稀釋后采用分光光度法測定OD276和OD284，根據糠醛和5-羥甲基糠醛的標準回歸方程計算出含量。

1.3.3 蘋果酸含量的測定。蘋果酸的檢測利用的是Goodban法[12]。準確稱取蘋果酸標準樣品溶解并稀釋至不同濃度梯度，依次加入6.00 mL濃硫酸、0.10 mL 2，7-萘二酚溶液，于100 ℃的沸水中水浴20 min。反應結束后取出反應液并冷卻到室溫，采用分光光度法測定390 nm處吸光度，建立蘋果酸標準回歸曲線方程。

結果表明蘋果酸濃度在10.00～80.00 mg/L與吸光度具有良好的線性關系，線性方程為

Y3=0.009 2X3+0.030 7（R2=0.997 9），其中Y3為吸光度，X3為蘋果酸濃度。

取樣品溶液1.00 mL（蘋果酸濃度控制在10.00～80.00 mg/L）依照上述方法測定OD390處吸光度，根據線性方程計算蘋果酸含量。

1.3.4 曲霉發酵產蘋果酸的培養基。

曲霉發酵培養基：糖濃度100.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.5 g、（NH4）2SO4 2.0 g、CaCO3 70.0 g（單獨滅菌）。121 ℃下滅菌處理20 min。接種寄生曲霉，發酵培養120 h。

1.3.5 糠醛與5-羥甲基糠醛對發酵生產蘋果酸的影響。

在以葡萄糖為碳源的寄生曲霉發酵生產蘋果酸的培養基中分別添加不同濃度的糠醛和5-羥甲基糠醛（表1），于恒溫搖床中以200 r/min、30 ℃條件下發酵培養120 h。發酵結束后測定發酵液中蘋果酸含量。

1.3.6 活性炭對小麥麩皮酸解液的脫毒效果影響。

取酸解液100 mL，通過分別添加不同質量活性炭（m/V）、處理溫度和處理時間，研究活性炭添加量、處理溫度和時間對酸解液中糠醛、5-羥基糠醛的脫除效果。

脫除率=（脫除后的質量/脫除前的質量）×100%。

1.3.7 小麥麩皮酸解液發酵生產蘋果酸的可行性。

分別以葡萄糖、小麥麩皮酸解液和脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源，制備相同發酵培養基（發酵液中糖含量保持相同），在200 r/min 30 ℃發酵120 h，發酵結束后檢測蘋果酸含量。

2 結果與分析

2.1 小麥麩皮酸解液糠醛和5-羥甲基糠醛的含量測定

分別測定糠醛和5-羥甲基糠醛的吸光度后，帶入其線性方程，計算得到小麥麩皮酸解液中糠醛的濃度為（481.11±34.23）mg/L、5-羥甲基糠醛的濃度為（573.37±23.42）mg/L。這2種物質的濃度均低于文獻記載的采用高壓反應釜進行稀酸酸解后的最大值[13]，可能是該試驗使用的硫酸濃度較低和酸解溫度較低，產生的糠醛和5-羥甲基糠醛濃度也較低。

2.2 糠醛與5-羥甲基糠醛對曲霉發酵生產蘋果酸的影響

從圖1可以看出，糠醛和5-羥甲基糠醛含量對寄生曲霉發酵生產蘋果酸有明顯的抑制作用。抑制物添加量100 mg/L時，蘋果酸產量明顯降低，隨著發酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛含量的增加，蘋果酸產量繼續降低，說明發酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛含量越高，抑制作用越明顯，蘋果酸發酵產酸率越低。同時也可以看出糠醛對寄生曲霉發酵產生蘋果酸的抑制作用比5-羥甲基糠醛的抑制作用強烈。

2.3 小麥麩皮酸解液的脫毒條件優化

2.3.1 活性炭添加量對酸解液脫毒效果的影響。

在小麥麩皮酸解液中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（m/V）活性炭，在25 ℃下攪拌30 min，分析活性炭添加量對小麥麩皮酸解液脫除效果的影響，結果見圖2。

活性炭的比表面積和微孔容積高，容易吸附小分子量有機物，是一種常用的吸附脫除方法。由圖2可知，添加活性炭后，酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛脫除率迅速增大，說明活性炭的添加量對糠醛與5-羥甲基糠醛脫除影響顯著，也表明活性炭對糠醛與5-羥甲基糠醛具有較好的吸附能力。當活性炭含量超過1.0%時，糠醛的脫除率上升緩慢，最大脫除率為57.47%，5-羥甲基糠醛的曲線無明顯變化，最大脫除率為54.70%。活性炭添加量增大可以提高酸解液中抑制物的脫除率，但總糖含量損失較大[14]，因此該試驗選定活性炭濃度1.5%為最佳添加量。

2.3.2 處理時間對酸解液脫毒效果的影響。

小麥麩皮酸解液中活性炭添加量為1.5%（m/V），在25 ℃下攪拌10、20、30、40、50、60 min，分析活性炭不同處理時間對小麥麩皮酸解液脫除效果的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，處理時間對活性炭脫除糠醛、5-羥甲基糠醛的脫除效果有明顯影響。在10 min內，活性炭對糠醛和5-羥甲基糠醛的脫除率迅速上升，并隨著時間的延長而繼續提高;超過40 min后，脫除率增加不明顯，說明此時的活性炭吸附能力已飽和。活性炭對糠醛的脫除率略高于5-羥甲基糠醛，可能是5-羥甲基糠醛的疏水性比糠醛弱，影響了脫除效果，使得與活性炭的吸附力比糠醛與活性炭的吸附力弱[14-15]。

2.3.3 溫度對酸解液脫毒效果的影響。

向小麥麩皮酸解液中添加活性炭含量1.5%，分別在20、30、40、50和60 ℃下攪拌40 min，分析不同溫度條件對小麥麩皮酸解液脫除效果的影響，結果見圖4。

由圖4可知，處理溫度對糠醛、5-甲基糠醛的脫除率趨勢基本相同，影響也比較明顯。在20～30 ℃時，脫除率明顯上升，超過40 ℃后，脫除率呈下降趨勢，可能是較高的溫度破壞了活性炭與糠醛等物質的吸附作用力，降低了活性炭的吸附性質。

根據上述結果可知，小麥麩皮酸解液的脫毒最佳條件為活性炭添加量1.5%（m/V）、處理溫度30 ℃、處理時間40 min。在此條件下進行脫毒處理后，檢測得到糠醛含量173.93 mg/L，脫除率為63.87%;5-羥甲基糠醛含量為220.8 mg/L，脫除率達61.49%。

2.4 脫毒后小麥麩皮酸解液發酵生產蘋果酸的可行性

研究曲霉發酵生產蘋果酸耐受性發現，當糠醛和5-羥甲基糠醛含量低于200 mg/mL時，曲霉仍能進行發酵。分別以葡萄糖、小麥麩皮酸解液和最佳條件下脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源，發酵生產蘋果酸，分析小麥麩皮酸解液脫毒處理后發酵產蘋果酸的可行性，結果見圖5。

47卷11期郭 娜等 小麥麩皮酸解液脫毒發酵制備蘋果酸的可行性

由圖5可知，以葡萄糖、小麥麩皮酸解液和脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源發酵制備蘋果酸的產酸量分別是2543、8.32、15.56 g/L。小麥麩皮酸解液脫毒后發酵產蘋果酸的量相對于未脫毒前的產酸量明顯增高，說明小麥麩皮酸解液經活性炭吸附脫毒后可以用于發酵產蘋果酸。

3 結論與討論

糠醛與5-羥甲基糠醛對寄生曲霉發酵生產蘋果酸有明顯的抑制作用，糠醛與5-羥甲基糠醛的含量越高，對蘋果酸發酵的抑制作用越顯著。使用活性炭對小麥麩皮酸解液進行脫毒處理，最適條件為活性炭含量1.5%、處理溫度30 ℃、時間40 min;在此條件下，小麥麩皮酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛的脫除率分別達63.87%和61.49%。酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛含量下降至200 mg/L左右，顯著降低了這2種抑制物對小麥麩皮酸解液發酵生產蘋果酸的抑制作用。經活性炭處理后的小麥麩皮酸解液作為碳源進行發酵生產蘋果酸是可行的。

隨著市場對L-蘋果酸的需求量日益增大，采用非糧資源如小麥麩皮和玉米秸稈等，通過糖化和脫毒處理降低抑制物含量，基因技術選育纖維素水解物耐受性菌株進行發酵生產L-蘋果酸是一條經濟可行和可持續發展的途徑[16]。

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