補骨脂的不同提取物對大鼠毒性的初步研究*

王昭昕 楊 莉 盧國彥 王躍飛 張 玥,2 周 昆,2

(1.天津中醫藥大學中醫藥研究院, 天津 300193)(2.天津中醫藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 300193)

補骨脂是傳統中藥材，為豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實，含香豆素類、黃酮類和單帖酚類等化合物[1]，具有補腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功能，外用可治牛皮癬、斑禿、銀屑病等皮膚病；補骨脂應用廣泛，僅藥典中收載的含補骨脂的中成藥就有30余種，其他標準和臨床醫師處方中就更多。補骨脂最早見于《雷公炮灸論》云：“性本大燥，毒。”后世醫家對補骨脂也有論述，《開寶本草》云：“治五勞七傷，風虛冷，骨髓傷敗，腎冷精流及婦人血氣墮胎。”但對其毒性記載甚少。近年來，隨著醫藥科學的發展，人們對補骨脂的研究也越來越深入，臨床不良反應以及毒性研究的報道也越來越多，補骨脂藥材乃至水提物對動物的肝毒性也被不同的實驗證實[2-6]，但是中藥的提取方式眾多，獲取的提取物的成分和安全性也會有差別，我們對補骨脂的三種不同提取物進行了口服給藥4周的大鼠毒性實驗研究，以評價不同提取物的安全性，為后續補骨脂提取工藝的改進和入藥的選擇提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

補骨脂藥材(原藥材)、補骨脂生藥粉、補骨脂下層滲漉液、補骨脂上層滲漉液、補骨脂滲漉藥渣：均為天津中醫藥大學中醫藥研究院王躍飛副研究員團隊制備提供，產品批號：20120920。

補骨脂生藥粉：補骨脂藥材直接粉碎，制成的棕色補骨脂生藥粉；

補骨脂下層滲漉液(每克提取物折合生藥2.66 g)：補骨脂原藥材經70%乙醇浸泡后滲漉，滲漉液減壓回收，靜置分層，稠浸膏與環糊精混合制得補骨脂提取物；

補骨脂上層滲漉液(每克提取物折合生藥18.43 g)：補骨脂原藥材經70%乙醇浸泡后滲漉，滲漉液減壓回收，靜置分層，上層60 ℃減壓烘干，制得滲漉上層干膏提取物。

補骨脂滲漉藥渣(每克提取物折合生藥1.18 g)：補骨脂原藥材經70%乙醇浸泡后滲漉，滲漉藥渣再次水提，60 ℃減壓烘干，制得滲漉藥渣提取物。各受試樣品成分含量如下(表1)。

表1 受試樣品成分含量Table 1 Contents of the components of the test sample

1.2 動物及飼養

SPF級SD大鼠112只，雌雄各半，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2009-0015。動物飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(津)2014-0002。所用飼料為全價顆粒飼料，天津市華榮實驗動物科技有限公司生產。

1.3 試劑與儀器

TBA(總膽汁酸)、CRE(血清肌酐)、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、TP(總蛋白)、ALT(天冬氨酸氨基轉氨酶)、ALP(堿性磷酸酶)、ALB(白蛋白)、BUN(尿素氮)以及AST(丙氨酸氨基轉換酶)試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司生產。

丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(比色法)均由南京建成生物工程研究所生產。

離心機(賽默飛，Legend Micro17型)；恒溫培養振蕩器(上海世平實驗設備有限公司，SPH-103B型)；全自動封閉脫水機(Leica，ASP300S型)，切片機(Leica，RM2135型)；顯微鏡(OLYMPUS，BX51型)；包埋機(天津航空機電公司，BMJ-1型)；多功能酶標儀(Tecan，InfiniteM200型)；全自動生化分析儀(日立，7020型)。

1.4 方法

具體實驗方法參考了文獻[4]中描述的中藥長期毒性實驗方法。

1.4.1分組與給藥:將大鼠按體質量、性別隨機分為8組：對照組(對照組與補骨脂水提物與水提藥渣的毒性比較研究相同)、補骨脂生藥3 g生藥/kg劑量組，補骨脂下層滲漉液6 g生藥/kg、3 g生藥/kg劑量組，補骨脂上層滲漉液6 g生藥/kg、3 g生藥/kg劑量組，補骨脂滲漉藥渣6 g生藥/kg、3 g生藥/kg劑量組，每組14只，連續灌胃給藥4周，最大給藥劑量為2015版藥典規定給藥劑量的6倍。

1.4.2一般狀況觀察:給藥期間，每周稱體質量一次，并根據體質量調整給藥劑量；每天給藥前后觀察動物的毛色、進食、活動等情況。

1.4.3血清生化檢測:給藥期結束，動物禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛進行麻醉。由腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離得到血清，通過自動生化儀檢測TBA、CRE、TC、TG、TP、ALT、ALP、ALB、BUN、AST。

1.4.4MDA和T-AOC的含量測定:肝臟加生理鹽水研磨制備10%的勻漿，用南京建成T-AOC和MDA試劑盒測定大鼠肝臟中T-AOC和MDA的含量。

1.4.5臟器系數及組織病理學檢查:剖腹小心摘取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺稱重，計算臟器系數(臟器質量/體質量)。切取大鼠肝臟一葉、左腎于10%中性甲醛溶液中固定，固定液為組織體積的5～10倍，固定48 h，石蠟切片，常規 HE染色，光鏡下觀察組織病變。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 對大鼠一般情況和體質量的影響

給藥期間，大鼠進食、活動情況正常，毛色無異，各組動物均無死亡。補骨脂不同提取物灌胃給藥4周對大鼠體質量的影響如下(表2,表3)：與對照組相比，雄性大鼠下層滲漉液高劑量組在第2周體質量顯著降低；雌性大鼠滲漉藥渣高劑量組第4周的體質量顯著升高，其他組無顯著變化。

表2 不同提取物的補骨脂對雄性大鼠體質量的影響Table 2 Effects of Psoralen from different extractions on Body Weight of Male Rats

注：與對照組比較，*P<0.05

Note:*P<0.05 vs control group

表3 不同提取物的補骨脂對雌性大鼠體質量的影響Table 3 Effects of Psoralen from different extractions on Body Weight of Female Rats

注：與對照組比較，*P<0.05

Note:*P<0.05 vs control group

2.2 對大鼠血清生化影響

與對照組比較，雄性大鼠生藥組ALT、ALP、TBA、T-CHO、ALB顯著降低；下層滲漉液高劑量組ALT、BUN顯著升高，T-CHO、ALB顯著降低；下層滲漉液低劑量組TBA、TG、T-CHO顯著降低；滲漉藥渣低劑量組ALT、TBA、ALB顯著降低；上層滲漉液高、低劑量組、滲漉藥渣高劑量組無顯著性差異。雌性大鼠生藥低劑量組ALP顯著升高；下層滲漉液高劑量組BUN顯著升高，ALB顯著降低；下層滲漉液低劑量組ALT顯著升高，CRE顯著降低；上層滲漉液高劑量組BUN顯著升高；滲漉藥渣高劑量組ALT、AST顯著降低，TBA、T-CHO、BUN顯著升高；滲漉藥渣低劑量組TP顯著升高(表4,表5)。

2.3 對大鼠肝臟MDA和T-AOC的影響

與對照組比較，雄性大鼠生藥低劑量組，滲漉藥渣高劑量組MDA顯著升高；下層滲漉液高、低劑量組，滲漉藥渣低劑量組T-AOC顯著升高。雌性大鼠生藥低劑量組，滲漉藥渣高劑量組MDA顯著升高，T-AOC顯著降低；下層滲漉液高劑量組T-AOC顯著降低；滲漉藥渣低劑量組MDA顯著降低，T-AOC顯著降低(見表6,表7)。

表4 不同提取物的補骨脂對雄性大鼠血清生化指標的影響(一)Table 4 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Male Rats(1)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group

表4 不同提取物的補骨脂對雄性大鼠血清生化指標的影響(二)Table 4 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Male Rats(2)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

表5 不同提取物的補骨脂對雌性大鼠血清生化指標的影響(一)Table 5 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Female Rats(1)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group

表5 不同提取物的補骨脂對雌性大鼠血清生化指標的影響(二)Table 5 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Female Rats (2)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group

表6 不同提取物的補骨脂對雄性大鼠MDA的影響Table 6 Effects of Psoralen from different extractionson MDA in Male Rats

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

表7 不同提取物的補骨脂對雌性大鼠MDA的影響Table7 Effects of Psoralen from different extractionson MDA in Female Rats

注：與對照組比較，**P<0.01,***P<0.001

Note:**P<0.01,***P<0.001 vs control group

2.4 對大鼠臟器系數及組織病理學的影響

與對照組相比，雄性大鼠生藥低劑量組胸腺系數顯著降低而肝、腎系數顯著升高；下層滲漉液高劑量組，滲漉藥渣高、低劑量組肝、腎系數顯著升高而胸腺系數顯著降低。雌性大鼠下層滲漉液低劑量組，滲漉藥渣低劑量組肝、腎系數顯著升高而胸腺系數顯著降低；生藥低劑量組，滲漉藥渣高劑量組肝、腎系數顯著升高；下層滲漉液高劑量組肝系數顯著升高而胸腺系數顯著降低；上層滲漉液低劑量組肝系數顯著升高，其他各組的值比較差異不具有統計學意義(見表8,表9)。

光鏡下觀察，給藥組大鼠的肝臟、腎臟和生殖器官未見明顯的組織病變，與對照組無明顯差別。

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

3 討論

本實驗為研究不同提取物補骨脂大鼠口服給藥毒性，分別設立對照組、補骨脂生藥組，補骨脂下層滲漉液低、高劑量組，補骨脂上層滲漉液低、高劑量組，補骨脂滲漉藥渣低、高劑量組。實驗所需補骨脂生藥和不同提取物的最大給藥量為2015版藥典規定的6倍。實驗結果表明：與對照組相比，補骨脂生藥組肝臟臟器系數、ALP、MDA明顯升高，胸腺臟器系數、T-AOC顯著降低，再次證明補骨脂生藥給藥4周即對大鼠肝臟有一定的損傷。補骨脂下層滲漉液組肝臟臟器系數、T-AOC、ALT也顯著升高，表明補骨脂下層滲漉液也對肝臟有一定的損傷，但雄性大鼠T-AOC值明顯升高；補骨脂滲漉藥渣高劑量組肝臟臟器系數、MDA顯著升高而雌性大鼠T-AOC值顯著降低；表明補骨脂滲漉藥渣高劑量給藥4周對肝臟有一定的損傷，而滲漉藥渣低劑量組并沒有肝、腎毒性指標出現顯著性，表現出較好的劑量相關性；補骨脂上層滲漉液沒有明顯毒性。總結實驗結果也顯示三種不同提取物中滲漉藥渣的肝毒性最大，其次為下層滲漉液，上層滲漉液的安全性最高。

對三個不同提取物中有效成分的含量測定結果顯示，補骨脂上層滲漉液中有效成分的含量極少，其中含量最多的補骨脂酚也只有2.26‰，滲漉藥渣中含有較多的補骨脂苷和異補骨脂苷，而補骨脂酚含量極少僅0.58‰，因此二者不適合用作藥用；而下層滲漉液中沒有檢測到補骨脂苷和異補骨脂苷，補骨脂素、異補骨脂素的含量也不多，但補骨脂酚的含量高達58.72‰，有研究認為，補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素是補骨脂中的主要毒性成分[4]。白茹玉等[8]研究結果表明，大劑量補骨脂素給予小鼠時，引起藥物急性毒性反應；異補骨脂素可引起 HepG2 細胞內膽汁酸升高和細胞毒性[9]；還有研究表明異補骨脂素和補骨脂素對小鼠肝功能有一定影響[10]；補骨脂乙素可抑制Tca8113細胞的增殖并誘導細胞凋亡[11]。同時，已有研究證實補骨脂素和異補骨脂素對小鼠骨質疏松有較好的治療作用[12]，劉穎等[13]的研究表明，補骨脂對維甲酸誘導的大鼠骨質疏松有治療作用。而補骨脂酚是毒性相對較小有效成分，有抗菌、抗腫瘤、降糖降血脂、抗氧化、消炎、雌激素樣等作用[14-18]。綜上，下層滲漉液更合適入藥。當然，這一結論尚需更多的藥效和安全性評價研究來支持。