不同墊料對SPF級KM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

胡建武 李樹梅 梁俊仕 余光禎 李 亮 武會娟 陳禹保

(北京實驗動物研究中心，北京 100012)

墊料是實驗動物生存環(huán)境中的接觸性基礎(chǔ)材料，不同的墊料生存環(huán)境直接影響實驗動物的生理活動，進(jìn)而影響動物實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇不同墊料也是體現(xiàn)動物福利的重要內(nèi)涵。因此，實驗動物國家及地方標(biāo)準(zhǔn)對實驗動物墊料的物理性狀、化學(xué)及生物特性都有明確的規(guī)定和要求。目前所知實驗動物品種、品系、年齡、性別等對實驗動物記憶能力均有不同程度的影響，但未知不同墊料飼養(yǎng)環(huán)境對實驗動物記憶認(rèn)知能力是否有影響。為了進(jìn)一步探索新型麥秸墊料的安全性及其對嚙齒類實驗動物接觸環(huán)境的影響,本實驗采用SPF級昆明小鼠為研究對象，應(yīng)用MORRIS水迷宮行為學(xué)實驗方法，比較、開發(fā)利用新型麥秸墊料和其他3種墊料(刨花墊料、玉米芯墊料和紙質(zhì)墊料)在工作狀態(tài)下對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和血液生化指標(biāo)的影響。為今后開展與改善學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)藥物研究的實驗動物墊料選擇提供參考，也為新型麥秸墊料的安全使用和大力推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠 (孕13 d) 8只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)在北京實驗動物研究中心屏障設(shè)施內(nèi) [SYXK(京)2015-0046]，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，溫度：18～26 ℃，濕度：38%～50%。維持12/12 h明暗交替光照。所有實驗操作遵循動物使用相關(guān)倫理要求，福利倫理審查批準(zhǔn)號：BLARC-2017112401。

1.2 墊料及主要儀器

1.2.1新型麥秸墊料：利用蒸汽爆破工藝對麥秸稈原料進(jìn)行爆破，做進(jìn)一步處理后，進(jìn)行60Co照射及真空包裝后獲得新型麥秸墊料。玉米芯墊料、刨花墊料均購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；紙質(zhì)墊料購自北京美綠洲生物科技有限公司。

1.2.2主要儀器：超凈工作臺(蘇杭)；電子天平(Sartorius，BSA220ZS型)；水迷宮(ZS-001MORRIS)，ZS-001 MORRIS水迷宮動物行為分析系統(tǒng)(眾實迪創(chuàng)，購自北京美綠洲生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗分組：8只KM孕鼠單籠飼養(yǎng)，2只/籠，分別飼養(yǎng)在麥秸墊料、玉米芯、刨花和紙質(zhì)4種墊料中。選取離乳后仔鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只，雌雄各半，分別按照使用墊料的不同分為麥秸墊料組、玉米芯組、刨花組和紙質(zhì)墊料組。每周更換一次墊料，常規(guī)飼養(yǎng)。在相同環(huán)境條件下繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，觀察各組小鼠的相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.2適應(yīng)性觀察：觀測KM小鼠分別對4種墊料飼養(yǎng)適應(yīng)情況，觀察小鼠行為反應(yīng)、身體清潔度、有無外傷及過敏、嚼食墊料等情況。

1.3.3水迷宮行為學(xué)測試：應(yīng)用ZS-001 MORRIS水迷宮實驗裝置，開展隱藏平臺實驗和空間探索實驗，檢測小鼠在水迷宮裝置中的學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.3.3.1 定位航行實驗：連續(xù)6 d分別對麥秸、刨花、玉米芯及紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)的4組小鼠進(jìn)行入水訓(xùn)練和測試，每天訓(xùn)練4次，確保4個象限每天只用1次。第一天為適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠放入不含平臺的水池中自由游泳120 s，每次訓(xùn)練完成后，迅速用干凈的干毛巾將小鼠擦拭干凈后放回籠盒，并保證其飲水和食物供應(yīng)，便于小鼠提前適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激反應(yīng)。其余5 d為正式試驗，每天固定時間訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔15～20 min。訓(xùn)練時間設(shè)置為90 s，90 s內(nèi)小鼠未找到站臺，則由實驗人員將其引導(dǎo)至站臺，并在站臺上停留10 s，逃避潛伏期記為90 s。將逃避潛伏期均值作為參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3.3.2 空間探索實驗：實驗時間為1 d，去除平臺中心支架，任選一個象限入水點將KM小鼠放入水中，測試60 s小鼠在恒溫池中的游泳時間以及穿越目標(biāo)(原平臺位置)的次數(shù)。

1.3.4體質(zhì)量的檢測：實驗期間，每天實驗前對所有小鼠進(jìn)行稱重并記錄。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 動物適應(yīng)性研究

通過實驗觀察，麥秸墊料對小鼠無刺激作用，小鼠行為、反應(yīng)正常。同其他3種墊料相比，換墊料1周后，麥秸墊料相對干燥度良好；相比玉米芯墊料，沒有尿液集中滲漏的情況；相比紙質(zhì)墊料，沒有排泄物裸置的情況。

2.2 定位航行實驗

逃避潛伏期結(jié)果如表1所示。在5 d的定位航行實驗中，各組小鼠的潛伏期均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短，由此可知，在4種墊料飼養(yǎng)環(huán)境下的KM小鼠經(jīng)過訓(xùn)練后均可獲得一定的空間學(xué)習(xí)能力。由圖1可見，自第2天起，麥秸組、玉米芯組和紙質(zhì)組的潛伏期呈下降趨勢，其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優(yōu)勢。進(jìn)一步對組內(nèi)各時間點的潛伏期進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，第5天的潛伏期麥秸組顯著低于其他3組(P<0.05)，其余各組間兩兩比較差異不顯著，由此可見經(jīng)麥秸墊料飼養(yǎng)下的KM小鼠在空間學(xué)習(xí)能力可得到明顯的提高。

表1 KM小鼠水迷宮實驗結(jié)果(定位航行)Table 1 Results of Morris water maze(place navigation) test in KM mice

注：*P<0.05

Note:*P<0.05

2.3 空間探索實驗

實驗結(jié)果如圖2所示，各組小鼠穿過目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時間經(jīng)統(tǒng)計無顯著性差異(P>0.05)。但麥秸組的小鼠在穿過目標(biāo)象限的總次數(shù)、游泳時間上均表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，其中穿臺次數(shù)方面：麥秸組(3、2)最高、刨花組(1、2)、玉米芯組(1、2)，紙質(zhì)組(1)；游泳時間方面：麥秸組(17.09 s)、刨花組(11.22 s)、玉米芯組(12.21 s)、紙質(zhì)組(16.33 s)。這說明在麥秸墊料飼養(yǎng)條件下的KM小鼠可獲得良好的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其對空間定位的準(zhǔn)確性明顯高于其他3組。

圖1 不同墊料組小鼠定位航行實驗結(jié)果Fig.1 Results of the place navigation testin different bedding groups of mice

圖2 KM小鼠空間探索實驗結(jié)果Fig.2 Results of the spatial probe test in KM mice

2.4 墊料對KM小鼠體質(zhì)量的影響

KM小鼠經(jīng)四種不同墊料相同飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)8周后，體質(zhì)量均逐漸增加，結(jié)果見表2。其中麥秸組增重最大，刨花組增重最小，兩組間變化差異顯著(P<0.05)；水迷宮測試期間，各組增重兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果如圖3所示。

表2 不同墊料對KM小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of different beddings on body weight of KM mice

注：*P<0.05

Note:*P<0.05

圖3 各組小鼠水迷宮試驗期間體質(zhì)量增加百分比Fig.3 The increased body weight percentage ofeach group during the water maze test

3 討論

目前，MORRIS水迷宮實驗廣泛用于開展海馬功能、學(xué)習(xí)記憶機(jī)制、衰老、藥物對學(xué)習(xí)記憶障礙的改善、某些疾病對學(xué)習(xí)記憶功能的影響以及新藥的研發(fā)、藥物機(jī)型篩選、療效評價、衰老模型評價、康復(fù)醫(yī)學(xué)以及藥物毒理學(xué)研究等領(lǐng)域[1]。根據(jù)MORRIS水迷宮實驗原理可知，小鼠的自身生理因素和環(huán)境因素均會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響。李愛萍等[2]報道，受動物品系及遺傳背景的影響，在MORRIS水迷宮中不同品系的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力差異較為明顯。Wahlsten等[3]選用8個近交品系小鼠進(jìn)行水迷宮實驗，發(fā)現(xiàn)C57BL/6和DBA/2 J在迷宮試驗中表現(xiàn)良好，薛丹等[4]報道，C57BL/6小鼠、KM小鼠和ICR小鼠都能完成MORRIS水迷宮的定位航行實驗、空間搜索實驗和工作記憶實驗，且非空間因素對C57BL/6小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評價干擾較小。諸多學(xué)者以C57BL/6小鼠為研究對象，應(yīng)用MORRIS水迷宮實驗開展了神經(jīng)退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腦認(rèn)知系統(tǒng)的相關(guān)研究方面。如Huang等[5]研究脂多糖對記憶檢索的影響，探討免疫激活與學(xué)習(xí)記憶功能的相互作用。Stackman等[6]研究小鼠定向反應(yīng)與前丘腦神經(jīng)元之間的關(guān)聯(lián)。范琳犀等[7]研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮慢性注射可誘導(dǎo)C57小鼠抑郁行為發(fā)生改變并損害學(xué)習(xí)記憶功能。劉港等[8]研究結(jié)果表明，采用雄性KM小鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35可快速成功制備阿爾茨海默病(AD)小鼠模型。在定位航行實驗中，KM小鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而減少，這與本研究的結(jié)果一致。王南溪等[9]用水迷宮實驗測試不同劑量的黃粉蟲油脂對KM小鼠增重及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。胡華等[10]探討活血榮絡(luò)片治療阿爾茨海默病的機(jī)制。在MORRIS水迷宮實驗過程中，其測試結(jié)果不僅與動物種類有關(guān)，MORRIS水迷宮的實驗設(shè)備、實驗環(huán)境(光照、噪聲)等許多因素均會影響實驗結(jié)果。周海東等[11]發(fā)現(xiàn)平臺顏色可以改變大鼠的水迷宮成績，藍(lán)色平臺的大鼠學(xué)習(xí)能力提升速度快于白色平臺組。黃明[12]發(fā)現(xiàn)90 dB的噪聲(2 h/天)可以導(dǎo)致KM小鼠空間性學(xué)習(xí)記憶能力和情緒性記憶能力受損。

眾所周知，墊料作為嚙齒類實驗動物生存環(huán)境中的重要組成部分，其原料、形狀、大小等因素均會對實驗動物及動物實驗結(jié)果有不同程度的影響[13]。越來越多的研究表明，豐富環(huán)境可以對小鼠腦損傷具有復(fù)蘇的作用，可以改善其記憶和運(yùn)動能力，認(rèn)為環(huán)境豐富化對嚙齒類動物腦功能改善、減輕老齡化帶來的空間認(rèn)知和運(yùn)動缺陷等具有重要生物學(xué)意義[14-15]。

唐莉莉[16]研究發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境組的KM小鼠表現(xiàn)活躍，探索主動性增加，豐富環(huán)境強(qiáng)化小鼠的情緒學(xué)習(xí)記憶；而貧瘠環(huán)境組小鼠活動減少、情緒煩躁不安，氧化應(yīng)急水平下降，使機(jī)體抵抗外界不良環(huán)境的能力下降。吳冰潔等[17]通過對近交系衰老模型SAMP8小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)并證實了環(huán)境豐富能刺激、提高動物體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(Cor)水平，能減輕精神行為異常及顯著提高小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。李春祿等[18]通過對野生小家鼠和KM小鼠對豐富環(huán)境(鋸末墊料為主，普通環(huán)境基礎(chǔ)上添加玩具)的學(xué)習(xí)記憶能力影響實驗，發(fā)現(xiàn)早期的豐富環(huán)境飼養(yǎng)顯著縮短野生小家鼠的潛伏期，KM小鼠沒有顯著影響，而經(jīng)過學(xué)習(xí)訓(xùn)練野生小家鼠和KM小鼠的潛伏期都顯著縮短。野生小家鼠更有良好的可塑性和應(yīng)變能力，而實驗KM小鼠經(jīng)過馴化后對環(huán)境變化更容易適應(yīng)。因此，本實驗選用KM小鼠作為研究對象，這與我們的研究結(jié)果一致。但是，在刨花與玉米芯等常規(guī)墊料飼養(yǎng)中，結(jié)果顯示在4種墊料飼養(yǎng)環(huán)境下的KM小鼠經(jīng)過訓(xùn)練后均可獲得一定的空間學(xué)習(xí)能力，自第2天起，麥秸組、玉米芯組和紙質(zhì)組的潛伏期呈下降趨勢，其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優(yōu)勢，但差異不顯著。

據(jù)報道，大小鼠的迷宮實驗認(rèn)知和行為評價的差異也可能和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[19]，應(yīng)激狀態(tài)下人類和動物釋放的腎上腺皮質(zhì)激素影響記憶的形成，損害記憶的獲得和再現(xiàn)。在水迷宮浸水游泳的環(huán)境應(yīng)激下，除了因整體環(huán)境因素如墊料富集，增加小鼠的幸福感等對小鼠形成的保護(hù)作用，也應(yīng)該考慮到小鼠個體差異。我們在試驗中發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠的認(rèn)知能力顯著高于雄性，這與宿瑞敏[20]研究結(jié)果相一致。

本實驗發(fā)現(xiàn)，新型麥秸墊料可促進(jìn)KM小鼠體質(zhì)量增加，且增加情況要優(yōu)于玉米芯和紙質(zhì)墊料組，與刨花墊料組相比較差異顯著(P<0.05)；舒暢等[21]曾報道普通刨花墊料對KM小鼠體質(zhì)量的增加緩慢，本次結(jié)果與之相一致。水迷宮實驗顯示，4種墊料飼養(yǎng)下的小鼠差異不顯著，但結(jié)合實際飼養(yǎng)環(huán)境來看，紙質(zhì)墊料組的小鼠表現(xiàn)欠佳，不建議完全用紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)或開展相關(guān)研究。麥秸墊料組表現(xiàn)則明顯優(yōu)于刨花墊料和玉米芯墊料組，因此麥秸墊料可以作為實驗動物接觸性墊料推廣使用。