實驗動物支氣管鮑特桿菌檢測能力驗證結果與分析

邢 進 馮育芳 王 洪 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，實驗動物資源研究所，北京 102629)

能力驗證(Proficiency Testing)是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力。作為重要的外部質量評價活動，尋求并參加能力驗證是合格評定機構的責任和義務。合格評定機構應結合自身需求參加能力驗證以證明其技術能力[1]。中國食品藥品檢定研究院(以下簡稱中檢院)作為CNAS能力驗證提供者(Proficiency Testing Provider，PTP)已在實驗動物質量檢測領域開展了包括病毒[2-4]、細菌[5-7]和遺傳[8-9]在內的多項能力驗證活動。我們通過此前的能力驗證活動積累了一些經驗，得到了全國實驗動物質量檢測機構的支持。2017年，中檢院依據CNAS-RL02《能力驗證規則》和CNAS-RL03《能力驗證提供者認可準則》(ISO/IEC 17043∶2010)[10]運作NIFDC-PT-107“實驗動物呼吸道樣品中支氣管鮑特桿菌檢測”的能力驗證工作。支氣管鮑特桿菌是感染實驗動物的一種重要的呼吸道病原菌[11]，大鼠、豚鼠和兔等易感，引起支氣管肺炎癥狀[12],在實驗用豬中是引發豬萎縮性鼻炎的主要病原之一[13]。通過對支氣管鮑特桿菌的檢測能力驗證，初步評價參與實驗室對實驗動物呼吸道細菌的檢測能力。現將本次驗證的總體情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌種

支氣管鮑特桿菌(Bordetellabronchiseptica)ATCC 19395，產氣巴斯德桿菌(Pasteurellaaerogenes)ATCC 27883，大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC 44110分別購自美國模式培養物保藏中心(ATCC)和中國醫學菌種保藏中心(CMCC)，三株標準菌株用作本次能力驗證菌株，本實驗室保存。

1.2 培養基及試劑

血瓊脂培養基(Oxiod)，DHL瓊脂(北京三藥科技開發有限公司)，葡萄糖、蔗糖、三糖鐵、靛基質、尿素、半固體等生化鑒定培養基(北京三藥科技開發有限公司)，API 20E生化鑒定條(梅里埃)，革蘭陰性細菌鑒定板(BD、Vitek)，無菌脫纖維羊血(北京路橋技術股份有限公司)。

細菌保護液基礎液(本院食品化妝品檢定所提供)加入10%無菌脫纖維羊血制成此次比對樣品保護液。

DNA提取試劑盒(Qiagen)，DNA聚合酶(TAKARA)，瓊脂糖(TAKARA)。革蘭氏染色液(梅里埃)；兔抗支氣管鮑特桿菌免疫血清由本實驗室制備。

1.3 主要儀器

生物安全柜(Thermo Scientific A2)、恒溫培養箱(Thermo Scientific Heratherm)、全自動細菌鑒定儀(BD Phoenix-100、梅里埃VITEK 2 Compact)、冷凍離心機(Hettich)、凍干機(Labconco)。

1.4 菌株的培養與鑒定

三株驗證用菌種分別劃線接種于血瓊脂平皿(5%脫纖維羊血)復蘇，至36 ℃培養24 h。挑取初代培養物中單個菌落再分別轉種于血瓊脂平皿，相同條件培養后備用。

根據伯杰氏系統細菌學手冊[14]和國家標準[15]對三株驗證用標準菌株進行生化鑒定。

同時提取三種菌株的基因組DNA，擴增其16S rDNA[16]，經測序后與Genbank數據庫比對，驗證菌株的準確性。

1.5 樣品制備

將支氣管鮑特桿菌、產氣巴斯德桿菌和大腸桿菌分別用無菌生理鹽水制成菌懸液，與保護液按1∶10比例均勻混合，制成1份陽性和2份陰性樣品。樣品中菌含量約為107CFU/mL。三種樣品分裝于螺口1.5 mL無菌凍存管中，冷凍干燥，最終每管內固體含量約為50～120 mg/管。三種能力驗證樣品通過“國家認證認可監督管理委員會實驗室能力驗證平臺”(http://nlyz.cnca.cn/lab/index.jsp)隨機分組編號，每組3管樣品，包含1管陽性和2管陰性樣品，即包括支氣管鮑特桿菌(陽性)、產氣巴斯德桿菌(干擾陰性)和大腸桿菌各1管。實驗室無法通過樣品編號識別組別，可防止實驗室間對結果的相互自行比對。

1.6 樣品檢驗

1.6.1均勻性檢驗：在已制備的三種樣品中分別隨機抽取10管樣品進行均勻性檢驗，每管樣品重復測試2次。參照作業指導書和國家標準，在樣品管中加入500 μL滅菌水，充分混勻。取10 μL樣品懸液用滅菌生理鹽水10倍梯度稀釋至10-6，取稀釋至10-5和10-6的樣品液各100 μL均勻涂布于血瓊脂平皿。36 ℃培養24 h，觀察并計算菌落數。

1.6.2穩定性檢驗：設置五個溫度條件(37 ℃、23 ℃室溫、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃)，每種溫度放置20組樣品，檢測樣品在各溫度下的穩定性。37 ℃和23 ℃室溫中樣品每天取樣，4 ℃中樣品每3天取樣，-20 ℃中樣品每周取樣，-80 ℃中樣品每月取樣。參照作業指導書和國家標準，將樣品管中加入500 μL無菌水，用10 μL接種環接種一滿環菌液涂布于血瓊脂和DHL瓊脂上，36 ℃培養24 h，觀察是否有足量的可見典型菌落生長。

1.6.3樣品中雜菌的鑒定：制備樣品所用組分未經過滅菌處理，除比對用標準菌株外，其中可能含有其他環境中的細菌。將空白細菌保護液接種于血瓊脂平皿，36 ℃培養24 h，對生長出的雜菌進行鑒定。

1.7 樣品的包裝和運輸

1.5 mL螺口樣品管外層用封口袋包裝，置于適宜大小的干冰泡沫箱中，冷鏈快遞至參加實驗室。

1.8 參加實驗室

全國共25家實驗室報名參加本次能力驗證計劃，均如期反饋結果。其中各級實驗動物檢測機構16家，省級疾病預防控制中心實驗室1家，藥檢系統實驗室1家，科研院校實驗室6家，企業實驗室1家。實驗室所在地區分布見表1。

表1 參加實驗室所在地區分布Table 1 Region of participating laboratories

1.9 檢測方法和報告

本次能力驗證未規定測試方法，可參考標準中的檢測方法[13,15]。要求在收到樣品后10個工作日內反饋結果，并在規定期限內提交完整的檢測報告。

1.10 結果評價原則

本次計劃中，每個實驗室得到3份樣本，3份樣本的測定結果與標準結果完全一致時，即判定為滿意結果；任何1份樣品的測定結果與標準結果不一致時，即判定為不滿意結果；實驗室如未按時限反饋結果，亦判定為不滿意結果。

2 結果

2.1 菌株鑒定

三株驗證用菌株的菌落和菌體形態均符合各自特征。支氣管鮑特桿菌在血瓊脂上形成1 mm左右、灰白色、長時間培養可見輕微α溶血的菌落；革蘭氏陰性短桿菌；在DHL培養基上能夠生長，形成約2 mm無色半透明菌落。大腸桿菌在血瓊脂上形成1～1.5 mm左右，灰白色略扁的菌落，不溶血；革蘭氏陰性小桿菌，兩端鈍圓濃染；在DHL培養基上形成粉紅色中等大小菌落。產氣巴斯德桿菌在血瓊脂上形成1.5 mm左右，灰白色圓潤的菌落，不溶血；革蘭氏染色陰性小桿菌，兩極鈍圓濃染；在DHL培養基上生長，形成粉紅色中等菌落。

采用國家標準中的鑒定方法、API 20E、BD和Vitek細菌鑒定儀的鑒定結果準確、一致。血清凝集實驗僅支氣管鮑特桿菌與診斷血清發生凝集。16S rDNA序列比對結果與設定菌株相符。鑒定結果見表2。

表2 三種菌株鑒定結果Table 2 Identification result of three tested strains

注：A產酸(黃色)，K產堿(紅色)；W弱反應

Note： A: acid (yellow); K: alkaline (red); W: weak reaction

2.2 均勻性

三種樣品在血瓊脂平皿上的菌落數均達到1×107以上的預期指標，滿足均勻性要求。見表3。

表3 三種樣品均勻性驗證結果Table 3 The homogeneity verification resultsof three kinds of samples

2.3 穩定性

三種樣品在不同存放溫度下定期取樣，所制備樣品在37 ℃條件下可穩定存放20 d，23 ℃室溫下可穩定存放40 d，4℃下至少可穩定存放60 d，-20 ℃下至少可穩定存放180 d，-80 ℃條件下至少可穩定存放240 d。

2.4 雜菌鑒定

空白細菌保護液經培養后，在血瓊脂上可見有兩種雜菌生長，一種為1 mm左右白色菌落，不易乳化；革蘭氏陽性短桿菌，呈梭形。另一種為1 mm左右黃色菌落，革蘭氏陽性雙球菌。經BD細菌鑒定儀鑒定，分別為格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)和變異庫克菌(Kocuriavarians)。

2.5 結果反饋

根據結果評定標準，獲滿意結果的實驗室22個，占參加單位的88%；不滿意結果有3個，占參加單位的12%。不滿意結果中，兩個實驗室漏檢陽性樣本結果，結果全部為陰性；另一個實驗室將陰性干擾樣品檢為陽性。

3 討論

3.1 方法的選擇

在依據國家標準檢測支氣管鮑特桿菌時，血瓊脂上初代菌落的α溶血現象常不甚明顯，因此初代培養時以培養至40 h以上為宜。在初代培養時，同時接種DHL瓊脂平皿有助于可疑菌落的篩選。采用培養法時，根據CNAS-CL09[17]要求需對購置的或自制的培養基進行質量控制。即用標準菌株驗證相關培養基和試劑的有效性，避免培養基和試劑原因導致的培養和鑒定失敗。

如不采用國家標準中的分離培養方法，PCR方法可以快速得出結果[18-20]。PCR方法已經寫入豬病檢測的行業標準，用于檢測傳染性萎縮性鼻炎中支氣管鮑特桿菌的診斷[13]，效果優于分離培養法[21]。本次能力驗證參加實驗室主要采用的仍是分離培養和生化鑒定的方法。兩個實驗室采用了PCR方法，且其中一個為熒光定量PCR方法，均獲得了準確的結果。

3.2 不滿意結果原因分析

通過查驗不滿意實驗室原始記錄和報告，檢測錯誤的主要原因可能為操作時污染、可疑菌挑取錯誤、生化鑒定錯誤和原始記錄記錄不祥等幾個方面。對樣品的檢測操作應在生物安全柜中操作，避免各種污染引入。處理樣品時，應分裝保留部分樣品以備復檢。熟知陽性菌落的形態和特征對挑取可疑菌至關重要，根據血瓊脂和DHL瓊脂培養基中的特征形態，充分挑取足夠數量的可疑菌落，可以避免漏檢。對于可疑菌的生化鑒定，本次比對中有19家單位采用的是手工生化檢測，其中9家實驗室在原始記錄中未注明所使用生化試劑的品牌或來源，使用質量不穩定的生化試劑很可能誤導檢測結果的判斷。有三個實驗室采用自動生化鑒定儀，一個采用梅里埃API生化鑒定條，結果均準確。與此前能力驗證情況相似，相比純手工生化鑒定，采用自動細菌鑒定儀或鑒定條可以獲得更準確、穩定的結果。值得注意的是支氣管鮑特桿菌檢測可能得出動力陰性的結果。主要原因是支氣管鮑特桿菌在半固體培養基中延穿刺線生長緩慢，培養至7 d比較穩妥[22]。原始記錄是反映實驗結果的第一手資料，是對檢測活動的客觀反映，有助于檢測結果的追溯。原始記錄不詳或者錯誤，可直接導致錯誤結論。

3.3 總結

一次能力驗證的結果只能證明參加者在本次能力驗證活動的情況，不能說明其正常的檢測水平，只有持續參加同一項目的能力驗證活動，其總體結果才能反映實驗室的檢測能力狀況[1]。截止到本次能力驗證，連續參加4次及以上的有14家單位，表明實驗動物細菌能力驗證活動已經得到了全國業內的認可。

本次驗證中出現一例樣品管破碎情況。經確認后對樣品進行了補寄。樣品破碎原因可能是由于干冰致使樣品管變脆后受擠壓導致。提示對樣品管的材質應有更高的要求，也督促我們進一步完善和改進實驗動物能力驗證計劃，努力提高能力驗證樣品的質量，促進實驗動物質量檢測事業更好發展。