低功率微波對人正常及脂多糖誘導的牙周膜細胞增殖的影響

謝文泵　莊文捷　黃璇葉

【摘要】 目的：探討微波輻照對人牙周膜細胞增殖的影響。方法：運用微波理療儀（輸出功率調節為14 W）以連續波、垂直極化照射方式對人牙周膜細胞行微波輻射（頻率2 450 MHz），24、48 h后MTS法檢測人牙周膜細胞（hPDLCs）增殖效應。結果：微波輻照對健康hPDLCs增殖效應影響，微波照射24、48 h后，照射40 s組，實驗組中吸光度值（OD值）低于對照組（P<0.01）;微波輻照對炎癥hPDLCs增殖效應影響，微波照射24、48 h后，照射10、20、40 s組，實驗組中吸光度值（OD值）都低于對照組（P<0.01）。結論：長時間（40 s）低功率微波輻照健康人牙周膜細胞能明顯抑制正常牙周膜增殖，促進細胞凋亡。低功率微波照射10、20、40 s對炎性的人牙周膜細胞的增殖均具有明顯抑制作用，隨著微波輻射強度的增高對其增殖抑制率也愈大，呈現明顯的劑量依賴性。低功率微波照射時間為10～20 s時能抑制炎癥人牙周膜細胞過度增殖，又不影響人健康牙周膜細胞的增殖。

【關鍵詞】 低功率微波; 牙周膜細胞; 內毒素脂多糖; 細胞活力測定; 增殖效應

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.08.080 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）08-0-03

Effects of Low Power Microwave on Proliferation of Human Normal and Lipopolysaccharide Induced Periodontal Ligament Cells/XIE Wenbeng，ZHUANG Wenjie，HUANG Xuanye.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（8）：-167

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of microwave irradiation on the proliferation of human periodontal ligament cells.Method：Human periodontal ligament cells were exposed to microwave radiation（frequency 2 450 MHz） with microwave physiotherapeutic apparatus（output power adjusted to 14 W） under continuous wave and vertical polarization.The proliferation of （hPDLCs） in human periodontal ligament cells was detected by MTS method after 24 h or 48 h.

Result：The effects of microwave irradiation on the proliferation of healthy hPDLCs were observed.The absorbance（OD） value of the experimental group for 40 s was lower than that of the control group（P<0.01） after 24 h and 48 h of microwave irradiation.The effects of microwave irradiation on the proliferation of inflammatory hPDLCs were observed.The value of absorbance（OD） in experimental group for 10 s，20 s，40 s were lower than those in the control group（P<0.01）.

Conclusion：Human periodontal ligament cells irradiated by low power microwave for a long time（40 s） can significantly inhibit the proliferation of normal periodontal ligament and promote the apoptosis of human periodontal ligament.Low power microwave irradiation for 10 s，20 s，40 s can significantly inhibit the proliferation of inflammatory human periodontal ligament cells.With the increase of microwave radiation intensity，the inhibition rate of the proliferation of periodontal ligament cells is increased in a dose-dependent manner.Low power microwave irradiation for 10-20 s can inhibit the excessive proliferation of inflammatory human periodontal ligament cells without affecting the proliferation of healthy human periodontal ligament cells.

【Key words】 Low-power microwave; Periodontal ligament cells; Lipoplysaccharide; Cell viability assay; Proliferation effect

First-authors address：Peoples Hospital Affiliated to Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，China

牙周病是由多種致病微生物所致的慢性、間歇性非特異性感染性疾病，臨床上對牙周病尚無完善的、特效的治療方案。人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周組織中的主要細胞成分，不僅合成、分泌牙周膜基質中膠原纖維和蛋白多糖，還有降解膠原的能力。它是一類具有異質性及分化潛能的細胞，主要細胞成分包括成纖維細胞、未分化的間充質細胞及前體細胞。許多研究都證實在病理狀態或受到外界刺激下，細胞可被激活，增殖分化，可分化為成骨細胞和成牙骨質細胞，促進牙周組織的再生和修復[1-2]。研究表明細胞內毒素脂多糖（1ipopolysacchaddes，IJPS）可抑制hPDLCs的增殖，促使牙周膜細胞大量分泌TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子，是導致牙周炎發病的主要致病因素[3-4]。目前，利用人牙周膜細胞建立體外模型[5-6]，已成為研究牙周膜組織疾病的重要手段。

近年來，微波技術在醫學臨床上應用日趨廣泛，有學者利用微波局部治療牙周炎和邊緣性齦炎，取得一定療效[7-8]。低功率微波能改善局部血液循環，增強代謝過程，加強局部組織營養，并且它具有較強的抑菌作用，滲入深度大，能抑制或殺滅患部的細菌。將微波能量集中照射病變部位，被人體組織吸收后，產生微波熱效應、生物效應等，使局部組織溫度升高，動靜脈顯著擴張，血流速度和血循環量明顯增加，活血化瘀，促進血液循環，增加細胞膜通透性，使局部代謝及營養狀態得以良好改善，提高組織再生能力，促進局部炎癥消退[9]。本研究通過檢測hPDLCs受到低功率微波刺激后MTS法檢測hPDLCs增殖效應表達，探索低功率微波對人正常及脂多糖誘導的牙周膜細胞增殖的影響，為微波治療牙周炎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要器材和試劑

低糖DMEM培養基、胎牛血清（FBS）胰蛋白酶（GIBCO，USA），青-鏈霉素混合液（Hyclone，美國），MTS（Promega，美國），二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（sigma，USA），微波治療儀（新技術研究所，南京），酶聯免疫檢測（Biotek POWERWAVE，美國），倒置相差顯微鏡及攝像系統（NikonTS-100，日本）。

1.2 標本取材及原代培養

征求患者及家長同意，取12～17歲因正畸治療而拔除的健康前磨牙10例。術前患者用3%過氧化氫漱口，75%的酒精消毒口內及口周，拔牙過程中避免損傷牙周組織，拔牙后立即置于含雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml）的無菌PBS液中，在超凈臺內，用含雙抗的PBS液反復沖洗牙根面，除去血污，用手術刀片刮取根中1/3牙門周膜組織，在DMEM培養液浸潤條件下用眼科剪將牙周組織剪成1 mm3大小的組織塊。取6孔板，在每孔中央滴加少量含200 ml/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養液，用牙科鑷子將組織塊放入6孔板中的培養液中，每孔含5～6小組織塊。將高壓滅菌蓋玻片緩緩覆蓋于組織塊上，輕輕加壓，使培養液充盈于蓋玻片與組織塊之間，避免產生氣泡，加體積分數為10%的胎牛血清的DMEM培養液3 ml，置5%CO2，100%濕度的37 ℃細胞培養箱培養，每3天換液1次。第2天鏡下觀察組織塊有無細菌污染，細胞培養板要輕拿輕放，前3天盡量避免過多晃動培養板，此后在倒置顯微鏡下逐日觀察細胞游出情況、形態特征及生長狀況。

待組織塊周圍細胞生長密集后，需要進行原孔消化。棄舊培養液用PBS緩沖液輕輕漂洗2遍，無菌鑷子小心取出蓋玻片，滴加少量2.5 g/L的胰蛋白酶，使其剛好鋪滿板底。鏡下觀察細胞消化情況，當細胞質回縮變圓，細胞間隙變大時，棄胰酶，加體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養液3 min，終止消化。輕輕吹打，使細胞均勻分布于孔板內，換培養箱繼續培養。

1.3 細胞傳代培養

原孔消化后，待細胞生長達孔板底部表面積80%～90%時，進行傳代培養。

1.4 微波照射方法及分組

將第4代hPDLCs分為兩大組，其中健康牙周膜細胞組正常接種，而炎癥牙周膜細胞組加入含10 μg/ml的LPS的培養基進行誘導。分別按2×104個/ml的細胞密度接種于96孔板，每板分空白組、對照組和實驗組，空白組為不含細胞的DMEM培養液，其余兩組接種細胞，每組重復3孔，每孔接種100 μl，微波治療儀輸出模式為治療模式，輸出功率調節為14 W，實驗組照射時間分別為10、20、40 s。對照組不進行激光照射，其余條件同實驗組，微波照射通過96孔板板蓋照射，室溫為24 ℃。

照射后放回培養箱中繼續培養。

1.5 MTS法檢測hPDLCs增殖效應

MTS是一種用比色法來檢測細胞增殖和細胞毒實驗中的活細胞數量的檢測試劑。微波照射24、48 h后，分別取出相應孔板，每孔加MTS 20 μl，繼續培養4 h后終止培養，在酶標儀490 nm波長處測定各孔細胞吸光度值（OD值）。

1.6 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，計量資料數據以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間差異用成組t檢驗，檢驗水準=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微波輻照對健康hPDLCs增殖效應影響

微波照射24 h后，實驗組中輻照10 s和20 s同對照組相比，OD值差異無統計學意義（P>0.05），而照射40 s組，其OD值明顯低于對照組;照射48 h后，實驗組中40 s的OD值亦低于對照組，二者比較差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

2.2 微波輻照對炎癥hPDLCs增殖效應影響

微波照射24 h后，實驗組同對照組相比，OD值顯著低于對照組（P<0.05），呈劑量依賴性;照射48 h后，實驗組OD值低于對照組，二者比較差異有統計學意義（P<0.05）;但不同時間點實驗組兩者間差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

微波治療是將微波能量集中照射作用部位，被人體組織吸收后產生熱效應、生物效應等。微波的熱效應能夠達到殺菌作用且隨著功率的增大而殺菌作用增強，但對靶器官和鄰近組織、細胞損傷的可能性也隨之增大。選擇適宜功率的微波照射使其熱效應不足以破壞正常的細胞，又能通過其生物效應作用于靶組織使其達到調節功能，促進組織功能恢復的作用是研究的最終目的。本研究選擇低功率14 W的微波輻照健康人牙周膜細胞10、20 s，對正常牙周膜細胞增殖沒有影響，而輻照時間延長為40 s時就能明顯抑制正常牙周膜增殖，這種抑制作用一直延續到48 h仍然存在，提示臨床使用微波必須選擇好功率和時間，以免過強的熱效應損傷正常組織細胞;細菌產生的脂多糖LPS是牙周炎的誘發因素之一[10-12]。本研究根據Jung等[13-14]的實驗結果選擇10 μg/ml LPS誘導人正常牙周膜細胞模擬炎癥狀態下的牙周膜細胞，結果顯示14 W微波照射10、20、40 s對炎性的人牙周膜細胞的增殖均具有明顯抑制作用，隨著微波輻射強度的增高對其增殖抑制率也愈大，呈現明顯的劑量依賴性。早在20世紀70年代web等[15]對人正常細胞和癌細胞的微波頻譜進行研究發現，正常細胞和癌細胞的吸收頻譜有差異，微波能通過熱效應和非熱效應選擇性地殺傷腫瘤細胞，引起細胞形態學和功能學改變，導致細胞壞死或者誘導凋亡。因此筆者設想健康的牙周膜細胞和炎癥狀態的牙周膜細胞對微波的吸收頻譜也是有差異的。

總之，本實驗結果得出臨床上選擇14 W低功率微波照射時間為10～20 s時能抑制炎癥人牙周膜細胞過度增殖，又不影響人健康牙周膜細胞的增殖。

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