乳酸菌作為基因工程菌的研究進(jìn)展

黃佳明， 姜 寧， 張愛(ài)忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319）

乳酸菌是一類能從碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的一類細(xì)菌的總稱。常見(jiàn)的菌屬包括：乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸乳球菌和鏈球菌屬等。乳酸菌是全球公認(rèn)安全級(jí)的微生物，不具有致病性，也是益生菌的一種，有諸多的益生功能。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)引入新基因?qū)崿F(xiàn)其在工程菌中的表達(dá)，達(dá)到改變其代謝功能或表達(dá)出一些功能性蛋白的目的，如抗菌肽等。應(yīng)用基因工程技術(shù)改進(jìn)現(xiàn)有菌株或開(kāi)發(fā)新菌株是目前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著食品技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)健康要求的改變，采用食品級(jí)的乳酸菌作為基因工程宿主菌引起研究者的廣泛關(guān)注。

1 作為工程菌的生物學(xué)功能

乳酸菌作為工程菌是因?yàn)槠浔憩F(xiàn)出的眾多的優(yōu)勢(shì)。首先，與其他宿主菌相比，本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素，而且免去了分泌蛋白后期的分離純化步驟，可以直接實(shí)現(xiàn)活體菌株的飼喂。其次，由于分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，對(duì)乳酸菌有了更深層次的研究，對(duì)乳酸菌質(zhì)?；虻木唧w構(gòu)造和功能的進(jìn)一步了解，以及乳酸菌基因測(cè)序工作的完成（Altermann等，2005），推動(dòng)了乳酸菌在基因工程技術(shù)上的應(yīng)用。除此之外，乳酸菌具有黏附與定植功能，乳酸菌是有益菌，在人和動(dòng)物腸道中廣泛存在，增加對(duì)乳酸菌的攝入，可以改善動(dòng)物胃腸道的內(nèi)環(huán)境，也可間接減少有害菌的數(shù)量，增加食物的消化率。另外，有研究表明乳酸菌可以增強(qiáng)腸道屏障功能，腸道黏液有著抗炎癥和抗感染的功能，其可作為腸道的屏障，Ren（2018）等研究了乳酸菌對(duì)參與腸道黏液合成的杯狀細(xì)胞相關(guān)基因的影響，證明了其可以增強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá)，以及對(duì)損傷的杯狀細(xì)胞有一定的修復(fù)作用，也證明了其可提高腸道黏膜的修復(fù)和再生功能。乳酸菌還具有殺菌作用，乳酸菌可分泌一些有機(jī)酸，有機(jī)酸本身就有一定的抑菌能力，還能解離出H＋，引起病原體表面膜電位的變化，進(jìn)而使細(xì)菌死亡（Gálvez等，2014），也間接降低了環(huán)境的pH，抑制了有害菌生長(zhǎng)。乳酸菌本身能分泌一些抗菌物質(zhì)，對(duì)有害菌有一定的殺傷能力，如細(xì)菌素等。

2 基因工程宿主菌

2.1 乳酸乳球菌 乳酸乳球菌生長(zhǎng)快，代謝簡(jiǎn)單，基因組包含足夠的生物學(xué)信息，是安全級(jí)的微生物。自身不分泌蛋白酶，降低了外源蛋白被降解的風(fēng)險(xiǎn)。本身不分泌內(nèi)毒素，也不產(chǎn)生任何的有毒物質(zhì)，不會(huì)產(chǎn)生像大腸桿菌那樣的包涵體結(jié)構(gòu)，基因組小自身分泌的蛋白質(zhì)少，也有利于外源蛋白的分離純化。近年來(lái)，隨著電轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，各種表達(dá)載體和克隆載體的建立，以及根據(jù)乳酸菌的自身特性發(fā)明的多種誘導(dǎo)系統(tǒng)，使得乳球菌作為基因工程宿主菌被廣泛地研究。從表1可以看出，乳酸乳球菌近年來(lái)作為基因工程宿主菌的研究主要集中在作為口服疫的應(yīng)用上，基因ORF 6是豬繁殖和呼吸綜合征病毒基因，基因VP2是雞傳染病性法氏囊病毒的主要抗原蛋白，基因S1是通過(guò)PCR豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)的抗原蛋白基因得到的，基因DerP2是由塵螨引起的過(guò)敏性哮喘的過(guò)敏原基因，實(shí)現(xiàn)了各種病毒的免疫性抗原基因或抗原基因的衍生物在乳酸乳球菌中的表達(dá)。為由病毒引起的疾病動(dòng)物提供了一種有效的治療手段。

表1 異源基因在乳球菌中的表達(dá)

2.2 乳酸桿菌 乳酸桿菌主要存在于人和動(dòng)物的胃腸道中，是一種有益菌，在腸道中定植，有著諸多的益生功能。有研究發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了各種乳酸桿菌中質(zhì)粒的分離（Chassy等，1978)。雖然到目前為止，乳酸桿菌的研究沒(méi)有像乳球菌那么深入，但也已從乳酸桿菌中分離出了各種用于表達(dá)和翻譯的調(diào)控元件。隨著乳酸菌測(cè)序技術(shù)的完成，將其作為宿主菌的研究也越來(lái)越廣泛。由于乳酸桿菌相對(duì)于乳球菌作為宿主菌的研究起步較晚，所以直到現(xiàn)在乳酸桿菌還沒(méi)有食品級(jí)的表達(dá)載體，應(yīng)用的主要是由紅霉素或氯霉素等抗生素基因標(biāo)記的非食品級(jí)的表達(dá)載體。由表2中可以看出，乳酸桿菌中的干酪乳桿菌作為宿主菌得到了廣泛的應(yīng)用，主要表達(dá)的是引起動(dòng)物產(chǎn)生疾病的病毒抗原蛋白基因，將含有抗原基因的重組菌株通過(guò)口服或注射的方式導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)來(lái)間接引起動(dòng)物產(chǎn)生免疫性反應(yīng)。除此之外，由于乳酸桿菌可以實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物腸道中的定植和黏附，可以在乳酸桿菌中表達(dá)一些功能性蛋白，比如將抗菌肽以及一些酶制劑的基因?qū)肴樗釛U菌，將重組菌株直接飼喂動(dòng)物，這樣不僅減少了表達(dá)產(chǎn)物后期分離純化的麻煩，還可以實(shí)現(xiàn)功能性藥物在動(dòng)物胃腸道源源不斷的產(chǎn)生，持續(xù)發(fā)揮作用的目的。

表2 異源基因在乳酸桿菌中的表達(dá)

2.3 雙歧桿菌 雙歧桿菌是從人的糞便中分離出來(lái)的一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，廣泛存在與人和動(dòng)物腸道中以及口腔中，其有諸多的益生功能，可以維持腸道菌群平衡以及機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，對(duì)動(dòng)物的腹瀉有著很好的治療作用。從表3可以看出，雖然雙歧桿菌實(shí)現(xiàn)了多種外源基因的表達(dá)，但對(duì)其的研究還不夠深入，到目前為止，雙歧桿菌還沒(méi)有一套成型的表達(dá)系統(tǒng)。主要原因有兩個(gè)，一個(gè)是對(duì)其的研究較晚，2002年才實(shí)現(xiàn)基因的測(cè)序工作（Schell等，2002），另一重要的原因是雙歧桿菌中存在質(zhì)粒的菌株較少，有研究表明，在32株雙歧桿菌中僅有五株發(fā)現(xiàn)了有質(zhì)粒的存在，這些使雙歧桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展緩慢。但雙歧桿菌有著清楚的遺傳背景，隨著基因技術(shù)的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)雙歧桿菌的內(nèi)部改造，達(dá)到讓其作為優(yōu)秀工程菌的目的。其本身作為安全級(jí)微生物，以及具有可以在動(dòng)物腸道中定植的特性，使雙歧桿菌有著很好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

3 基因工程乳酸菌的應(yīng)用

3.1 在疫苗領(lǐng)域中的應(yīng)用 乳酸菌可以在黏膜系統(tǒng)黏附以及人和動(dòng)物腸道中定植，使其在疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用上引起了人們的關(guān)注。目前基因工程乳酸菌在疫苗中的應(yīng)用主要是作為疫苗的傳遞載體，已經(jīng)證明乳酸菌可以有效的在黏膜系統(tǒng)中傳遞，其克服了將功能性蛋白質(zhì)傳遞到黏膜組織的問(wèn)題。通過(guò)鼻內(nèi)途徑，證明了活的和殺死的乳酸菌疫苗菌株都能引起黏膜和全身免疫反應(yīng)。Wells（2011）研究表明，乳酸菌作為黏膜傳遞系統(tǒng)的可行性，這種新的傳遞系統(tǒng)已清楚地顯示出乳酸菌疫苗的免疫原性和保護(hù)性免疫的潛力。此外，乳酸乳球菌口服給藥可誘導(dǎo)抗原特異性口服耐受（OT）分泌重組抗原。與純化的抗原相比，乳酸菌作為傳遞疫苗在誘導(dǎo)OT方面更有效，這就避免了純化大量抗原的需要。這種方法在過(guò)敏反應(yīng)和抗原誘導(dǎo)的自身免疫性疾病中具有治療和干預(yù)作用。花生過(guò)敏（PNA）已成為世界范圍內(nèi)不可忽視的健康問(wèn)題。迄今為止，誘導(dǎo)黏膜耐受的過(guò)敏原特異性免疫治療已被廣泛認(rèn)為是PNA的主要治療策略。乳酸菌的安全特性和固有的益生菌特性使它們成為黏膜疫苗的有吸引力的遞送載體。Ren等（2014）利用轉(zhuǎn)基因乳酸乳球菌，通過(guò)不同的蛋白靶向系統(tǒng)產(chǎn)生花生過(guò)敏原Ara h 2，并觀察其對(duì)小鼠過(guò)敏性免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，與表達(dá)Ara h 2（LL1)胞質(zhì)形式的菌株相比，表達(dá)Ara h 2（LL2和LL3)的分泌和錨定形式的菌株在將Th2極化重新導(dǎo)向非過(guò)敏性Th1免疫應(yīng)答方面更有效。通過(guò)口服重組乳酸鏈球菌，還可以在局部水平觀察到SIgA和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。通過(guò)鼻內(nèi)注射（IN）途徑注射流感疫苗與常規(guī)肌肉注射相比更有吸引力。這表明，給藥的方式不僅僅只是一種形式，還具有一定的優(yōu)勢(shì)，除了全身抗體外，還有誘導(dǎo)局部保護(hù)性抗體的潛力，即S-IgA。Berlec等（2012)探索了在小鼠鼻內(nèi)免疫后誘導(dǎo)保護(hù)性抗體應(yīng)答中使用安全的佐劑系統(tǒng)。用乳酸乳球菌食品級(jí)的細(xì)菌抗原顆粒（BLPs)感染小鼠，研究發(fā)現(xiàn)，用BLPs疫苗免疫的小鼠，與沒(méi)用疫苗免疫的小鼠相比，在被同源或異源的病毒攻擊時(shí)被感染的機(jī)率顯著降低。證明了用BLPs佐劑接種的流感疫苗可有效增強(qiáng)全身和局部抗體應(yīng)答，對(duì)同源和異源病毒的感染有著顯著的保護(hù)作用。

表3 異源基因在雙歧桿菌中的表達(dá)

3.2 在飼養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用 基因工程乳酸菌在養(yǎng)殖領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景，首先乳酸菌本身添加到飼料中就可以改變飼料的品質(zhì)，提高飼料的消化率。其次如果將纖維素酶基因和淀粉酶基因通過(guò)基因工程手段實(shí)現(xiàn)在乳酸菌中的表達(dá)，這樣的乳酸菌用于青貯飼料，在乳酸菌作用的基礎(chǔ)上，還能分泌一些蛋白酶和淀粉酶，可以提高纖維素的降解率，有助于動(dòng)物的消化。高云航等（2015)設(shè)計(jì)合成的纖維素酶基因?qū)肴樗峋?，?jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，得到了對(duì)纖維素具有分解活性的表達(dá)蛋白，酶活力為0.57 U/mL。王艷（2017)將多黏類芽孢桿菌纖維素基因?qū)肴樗峋?，成功獲得了具有分泌能力的重組乳酸菌。證明了重組乳酸菌在飼料領(lǐng)域有著很好的發(fā)展前景，其在動(dòng)物中也有很好的應(yīng)用，剛出生的仔豬其消化道與腸道發(fā)育不完全，腸道菌群沒(méi)有定型，消化不良和腸道菌群功能紊亂引起的疾病使仔豬有著較高的死亡率。將基因工程的乳酸菌飼喂仔豬可以在一定程度上改善這個(gè)問(wèn)題。尹清強(qiáng)等（2006)將淀粉酶基因?qū)氲截i的消化道乳酸菌中，將重組菌株飼喂仔豬，不僅彌補(bǔ)了仔豬腸道菌群的內(nèi)環(huán)境問(wèn)題，同時(shí)表達(dá)的淀粉酶在腸道中實(shí)現(xiàn)分泌，也間接緩解了淀粉酶在仔豬腸道中分泌不足問(wèn)題。在動(dòng)物中的另一個(gè)應(yīng)用是構(gòu)建疫苗載體，如將一些引起動(dòng)物產(chǎn)生疾病的病毒的抗原基因在乳酸菌中表達(dá)，重組菌種作為活體疫苗飼喂動(dòng)物，這樣可以取得很好的防治效果。

4 小結(jié)與展望

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用。通過(guò)基因工程改造的乳酸菌有著更為廣泛的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)在微生態(tài)制劑、藥品、活菌疫苗、飼料添加劑等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用。但乳酸菌作為工程菌還存在一些需要解決的難題。首先就是大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)中的載體和標(biāo)記基因不是“食品級(jí)”的,“食品級(jí)”的應(yīng)用較少，存在安全隱患。其次乳酸菌在動(dòng)物腸道中定植存在耐受問(wèn)題。最后就是乳酸菌表達(dá)外源基因的表達(dá)量不是很理想，對(duì)功能性蛋白的表達(dá)研究也較少。這不僅是乳酸菌作為基因工程菌所存在的問(wèn)題，也是基因工程菌這個(gè)系統(tǒng)所面臨的問(wèn)題。乳酸菌是安全級(jí)微生物，必是未來(lái)發(fā)展的熱點(diǎn)。