針刺療法調節IBS-D大鼠腸道菌群結構和促進腸緊密連接的作用研究

李湘力， 蔡敬宙， 林泳， 劉小寧

（1.廣州市第一人民醫院中醫科，廣東廣州 510180；2.廣州市第一人民醫院消化科，廣東廣州 510180）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種非器質性因素的胃腸功能紊亂性疾病。據統計，有腸易激癥狀的人群占全球人口的5%～20%。而我國以腹瀉型腸易激綜合征（irritable bowel syndrome with diarrhea，IBS-D）為主[1]。近年來國內外研究不但發現針灸對改善IBS癥狀有顯著作用[2]，而且利用16 s高通量測序技術，進一步發現針灸能改變IBS患者腸道菌群結構[3]，但針灸對IBS-D腸道菌群改變特征以及可能的分子生物學機制認識仍然有限。本研究利用Wistar大鼠建立IBS-D模型，以針刺穴位為干預手段，選用匹維溴銨作為陽性對照藥物，觀察針刺對IBS-D的緩解作用，并采集糞便行16 s高通量測序分析腸道菌群變化，進一步研究差異菌群對腸上皮緊密連接ZO-1和Occludin的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

Wistar大鼠48只，SPF級，雄性，4周齡，體質量100～120 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（粵2013-0002），飼養于廣州醫科大學動物實驗中心SPF屏障系統，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明。實驗全程依據動物實驗倫理委員會要求開展。大鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表將大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥組和針刺組，共4組，每組各12只。

1.2 主要儀器與試劑

Illumina技術測序平臺（北京諾禾致源股份有限公司）；熒光定量PCR儀（qTower 2.0德國耶拿公司）；0.30 mm×10 mm華佗牌一次性無菌針灸毫針（蘇州醫療用品廠有限公司）；匹維溴安片（法國Abbott Healthcare SAS，批號：H20120127）；糞便DNA提取試劑盒（德國Qiagen DNA Stool Minikit，批號：51504）；RNAiso Plus試劑盒（日本Takara公司，批號：D9108A）；Real-time PCR相關試劑盒（上海基爾頓生物科技有限公司，批號：RR420）；引物合成（上海生工生物工程股份有限公司）；相關ZO-1/Occludin抗體（美國Abcam公司，批號：ab221547/ab216327）。

1.3 模型制備

參照文獻[4]方法制備IBS-D大鼠模型。將Wistar大鼠通宵光照12 h后，置于45℃環境溫度中刺激5 min，然后剝奪飲水24 h；再置于4℃低溫環境中3 min，給予夾鼠尾刺激1 min；接著水平振動120次/min，連續刺激40 min；剝奪食物24 h，持續3周，獲得IBS-D大鼠模型。

1.4 干預方法

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 觀察大鼠排便粒數并計算糞便含水量

在造模前、造模3周、治療2周后3個時間點于各組籠內墊清潔濾紙，計算8∶00AM-12∶00AM大鼠糞便粒數并稱質量，干燥放置24 h再稱質量，計算糞便含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%[5]。

1.5.2 大鼠糞便菌群16 s測序

實驗結束后取結腸內糞便1～2顆，采用Qiagen DNA Stool Minikit提取并純化糞便菌群DNA，行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，合格樣品于Illumina技術測序平臺型菌群測序分析，測序區域見表1。將相似度＞97%的序列Tag歸類為同一OUT并根據眾數原則對每個OUT行不同水平物種注釋，利用QIIME 1.8.0軟件計算樣品物種多樣性，Alpha多樣性以Shannon指數和Chao1指數顯示。統計不同水平OUT聚類情況，并分析相對豐度，對門水平和科水平進行討論。

表1 細菌16 s測序區域Table 1 Bacterial 16 s sequencing area

1.5.3 Real-time PCR檢測ZO-1、Occludin基因表達水平

取末端結腸按RNAiso Plus說明書提取RNA，然后行逆轉錄獲得cDNA；Real-time PCR反應按以下程序兩步法擴增：（1）預變性95℃，1 min，循環1次；（2）變性、退火延伸（95℃ 15 s，60℃ 30 s采集熒光），循環40次；反應結束后確認融解曲線和擴增曲線，采用2-ΔΔCt方法分析Ct值并制作標準曲線，計算ZO-1和Occludin基因的mRNA表達量，引物序列見表2。

表2 引物序列信息Table 2 Primer sequence information

1.5.4 免疫組化法檢測ZO-1和Occludin蛋白表達

結腸組織固定于4%多聚甲醛固定液中，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，石蠟中浸蠟和包埋，切片2.5 μm厚。65℃烤片1 h；室溫二甲苯和梯度乙醇脫蠟；抗原修復，將配好的枸櫞酸鹽加入高壓鍋內，先將液體煮沸，放入玻片高壓修復3 min，冷水緩慢冷卻高壓鍋后洗滌；3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶；血清封閉非特異性抗原；室溫孵育一抗1 h后4℃濕盒中過夜；37℃復溫30 min，吸走一抗后洗滌；37℃孵育二抗30 min后洗滌，DAB顯色，鏡下觀察染色情況，適時終止；蘇木素復染后洗滌；各級酒精脫水和二甲苯浸泡透明，中性樹脂封片。

1.表示反詰語氣，這種句子是用疑問句的形式表達肯定意思。可譯為“嗎”或“呢”。[4]203共6例。如：

1.6 數據處理

采用Graphad Prism 6.0和Adobe Illustrator CS5軟件分析繪圖。計量資料以均數±標準差（-x±s）表示，實驗數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，滿足正態分布及方差齊性后采用兩樣本t檢驗分析；相關性分析采用Spearman等級相關進行分析；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠排便粒數和性狀評價

表3結果顯示：造模前，各組大鼠排便粒數和糞便含水量無明顯差異（P＞0.05）；造模3周時，與正常組比較，模型組大鼠排便粒數和糞便含水量均明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療2周后，與模型組比較，針刺組大鼠排便粒數明顯減少、糞便含水量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），提示針刺能有效改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀。

表3 各組大鼠糞便含水量及糞便粒數比較Table 3 Comparison of fecal water content and pellet number of feces of rats in various groups (-x±s)

2.2 各組大鼠糞便菌群多樣性比較

圖1結果顯示：與正常組比較，模型組菌群α-多樣性顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組菌群豐度顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示針刺治療能有效增加IBS-D大鼠菌群多樣性，療效與西藥組相似。

圖1 各組大鼠腸道菌群α-多樣性Figure 1 Comparison of α-diversity of gut flora in various groups

2.3 各組大鼠糞便菌群構成比較

圖2 基于OUT聚類的細菌相對豐度Figure 2 Relative abundance of gut microbiota based on OUT clustering

圖2 結果顯示：基于OUT聚類結果，對各組大鼠糞便樣品不同水平的菌群相對豐度進行分析。門水平顯示IBS-D大鼠厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著下降，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度顯著升高；進一步分析科水平菌群相對豐度差異，提示IBS-D大鼠乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）相對豐度顯著下降，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）相對豐度顯著升高。針刺組能糾正上述菌群失衡，促使菌群結構趨于正常。

2.4 各組大鼠結腸組織緊密連接基因ZO-1和Occludin表達情況

圖3 各組大鼠結腸ZO-1和Occludin mRNA水平表達量比較Figure 3 Comparison of mRNA expression levels of ZO-1 and Occludin in various groups

圖3 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸組織緊密連接基因ZO-1和Occludin表達量明顯下降（P＜0.05）；治療后，針刺組ZO-1和Occludin表達量顯著提升，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且ZO-1表達量較Occludin表達量升高更加明顯。圖4和圖5免疫組化結果顯示：正常組、西藥組、針刺組3組ZO-1和Occludin兩種蛋白沿大鼠腸黏膜上皮細胞膜頂端呈整齊線狀分布，棕褐色信號較強。而模型組陽性染色明顯減弱，ZO-1和Occludin蛋白表達紊亂，呈非連續性，組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。提示針刺治療能上調大鼠結腸上皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達，其上調水平與西藥組基本一致。

2.5 針刺組緊密連接蛋白表達與差異菌群相關性

表5結果顯示：針刺組ZO-1和Occludin的表達量與乳酸桿菌科、雙歧桿菌科的相對豐度呈顯著正相關，與腸桿菌科無相關性。

圖4 大鼠結腸ZO-1和Occludin的表達（免疫組化，×100）Figure 4 Comparison of expression of ZO-1 and Occludin in rat colon of various groups（by immunohistochemistry，×100）

圖5 各組大鼠結腸ZO-1和Occludin免疫組化表達量比較Figure 5 Comparison of immunohistochemical expression quantity of ZO-1 and Occludin in rat colon of various groups

表5 針刺組緊密連接蛋白表達與差異菌群的相關性Table 5 Correlation coefficient between tight junction protein expression and differential bacteria at family level

3 討論

腸易激綜合征（IBS）是我國胃腸病門診常見的病種，由于其病情反復、服藥療程長，給患者和家庭帶來嚴重困擾。目前，IBS的發病機制尚不清楚，是一種涉及腸道菌群、胃腸動力、內臟異常敏感、精神心理等多因素的疾病[6]。隨著高通量測序的發展，研究[7]發現IBS患者腸道菌群多樣性下降，其中，腹瀉型IBS（IBS-D）較便秘型IBS（IBS-C）的腸道菌群改變更顯著，表現為變形菌門豐度增加，優勢菌群豐度下降為特征的菌群改變。

基于腸道菌群在IBS發生發展中的重要作用，西醫常以口服益生菌調節腸道菌群為治療手段。但作為外源性補充的益生菌，存在定植困難、停藥后復發等缺點。隨著中醫針灸的發展，國內外越來越多研究表明，針灸對IBS-D的療效顯著，并且在調節腸道菌群結構方面具有重要作用[8，9]。國內學者回顧針灸對腸道菌群影響的相關研究，其中涉及手針、電針和艾灸等多元化的針灸方法，在不同疾病種類、選穴和治療時間的基礎上，發現針灸療法具備以上調乳酸桿菌、雙歧桿菌為特征的腸道菌群調節作用[3]。結合本研究結果，針刺治療組的排便顆粒、糞便含水量顯著下降，腸道菌群改變較口服匹維溴銨更為明顯，有效地下調了含較多致病菌的變形菌門的相對豐度；進一步分析科水平菌群結構變化，乳酸桿菌科和雙歧桿菌科豐度均顯著上升，腸桿菌科豐度顯著下降，此與國內外針灸介導腸道菌群結構變化的結果類似。

緊密連接蛋白是位于腸上皮相鄰細胞鏈接頂側面的蛋白復合體，其中膜周蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin是重要的骨架蛋白，腸上皮緊密連接保持了上皮屏障的完整性，并能調節上皮屏障選擇性的通透作用，是維持黏膜內環境穩態的重要蛋白[10]。研究[11]表明，ZO-1的表達下降，不僅是潰瘍性結腸炎的始動因素之一，在IBS-D患者的腸黏膜組織中，也發現不同程度的下降。而腸內益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌的相對豐度上升，能上調腸上皮緊密連接蛋白的表達[12，13]。本研究中，IBS-D模型組mRNA水平和蛋白水平的ZO-1、Occludin表達量明顯下降，經針刺治療后，二者表達量顯著增高。分析結果顯示針刺治療IBS-D模型大鼠結腸組織的緊密連接蛋白表達量與乳酸桿菌科和雙歧桿菌科的相對豐度呈顯著正相關。

本研究以針刺治療改變IBS-D的腸道菌群結構為切入點，進一步研究了結合相對豐度顯著增加的菌群與腸上皮緊密連接的相關性，探究針刺治療改變菌群結構進而影響腸屏障功能的可能。實驗發現，針刺后IBS-D模型大鼠腸道菌群的α-多樣性上調，主要菌門構成比發生改變，有效地糾正了IBS-D模型大鼠菌群多樣性下降和變形菌門過度增長為特點的菌群紊亂。同時驗證了腸上皮細胞ZO-1、Occludin等緊密連接蛋白的表達量與差異菌群顯著相關。從中醫角度而論，IBS-D并無特定病名，常歸于“郁證”、“泄瀉”論之，具有病位在腸，涉及肝、脾、腎三臟的特點[14]，利用目前的IBS-D臨床文獻，采用傳統辨證與聚類法分析10余種證型，眾多醫家認為“肝郁脾虛、肝脾失和”是引起IBS-D的主要病機之一，“飲食不節、情志失調”為其重要病因[15，16]。本研究采用針刺治療，選穴為天樞、大橫、足三里、上巨虛、太沖和百會穴。天樞乃足陽明胃經的要穴，也是大腸之募穴，能通調腸腑、條暢氣機；大橫為足太陰脾經穴位，具有健脾利水濕的作用；足三里合治六腑，是健脾益胃最有效的穴位；上巨虛是大腸下合穴，可治一切腸道疾患；太沖屬足厥陰肝經之原穴，且經絡循行至巔頂額部，配合督脈之百會穴。二者既可疏肝理氣、化生氣血，更可調理情志[17，18]；諸穴配伍行針，從病因、病機出發，可有效緩解IBS-D的臨床癥狀，而本研究更補充證明針刺可以上調腸內益生菌豐度，可作為單純口服外源性益生菌調整腸道菌群的替代方案，具備從整體、從根本論治，施術時間短，毒副作用少、無藥物依賴等優勢。

綜上所述，筆者推測針刺治療除具備疏肝健脾、理氣調神等功效，還能通過上調IBS-D菌群多樣性及益生菌相對豐度和介導ZO-1、Occludin等緊密連接蛋白表達，從而達到改善IBS-D癥狀的功能，并能一定程度上替代目前西醫常用治療方案。然而，腸道菌群改變與IBS互為因果，本研究中菌群改變與緊密連接蛋白的表達間的始動關系，仍需要進一步深入研究。針灸作為一種治療方法，不同穴位的選擇、治療時間的改變，對疾病的治療效果也不盡相同，需要更多的研究提供客觀依據。