熊果苷對膀胱癌EJ-1細胞增殖的影響及其機制研究

郭錦輝， 高衛芳， 鄧智建

（新鄉醫學院第一附屬醫院藥學部，河南新鄉 453100）

膀胱癌在發生發展的任何階段均能夠在幾個月內發生快速的腫瘤進展和轉移[1]。由于膀胱癌的高復發率，手術或者外部放射治療一直是治療的主要手段[2]，但其副作用較大[3，4]。目前，中藥提取物治療腫瘤成為研究熱點。熊果苷（氫醌-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）是從熊果的樹皮和葉子中提取的物質[5]。研究表明，熊果苷可抑制哺乳動物黑色素生成的限速酶酪氨酸酶[6]，被廣泛用于治療皮膚色素沉著異常癥狀（如黃褐斑和雀斑），也被用于生產部分皮膚美白化妝品[7，8]。且臨床已證實熊果苷在人體內是安全的，沒有明顯的毒副作用[9]。既往有研究表明，熊果苷具有作為抗腫瘤劑的潛在作用，可有效抑制膀胱癌細胞的轉移行為[10]。為進一步探討熊果苷在膀胱癌治療中的作用，我們從細胞周期調控角度觀察熊果苷對膀胱癌細胞EJ-1增殖的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養 人膀胱癌細胞EJ-1獲自武漢大學細胞培養物中心。于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中37℃、體積分數5%CO2條件下培養。

1.2 藥物、試劑與儀器 熊果苷購自美國Sigma公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；細胞外信號調節激酶（ERK）和磷酸化ERK（p-ERK）抗體購自美國Abcam生物公司；細胞周期蛋白（Cyclin D1）、p21購自美國圣克魯斯生物技術公司。全波長酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；Western blot轉印儀、電泳凝膠圖像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 MTT法測定EJ-1細胞增殖能力 將EJ-1細胞以2×106/孔接種在6孔板中培養24 h后分為6組，除對照組之外，其余各組分別加入10、20、50、100、500 μg/mL熊果苷處理24 h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液（用PBS配）20 μL。繼續孵育4 h，終止培養。小心吸棄孔內培養上清液，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度（D）值，記錄結果。細胞增殖抑制率（%）=（對照組D值-實驗組D值）/對照組D值×100%。再以同樣方法，測定100 μg/mL熊果苷作用EJ-1細胞24、48、72、96 h的細胞增殖抑制率。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡 將EJ-1細胞以2×106/孔接種在6孔板中培養24 h后，加入100 μg/mL熊果苷作用細胞24、48、72、96 h后，以胰蛋白酶消化制成單細胞懸浮液；將細胞調至5×105～1×106個細胞/管，并重懸于2 mL冰磷酸鹽緩沖液（PBS）中。收集細胞使其在乙醇4℃孵育1h后，除去乙醇，PBS清洗3次。將200μL PBS和2 μL核糖核酸酶溶液（0.25 mg/mL）加入到每個試管中于室溫處理30 min。再加入0.5 mL 50 μg/mL的碘化丙啶溶液室溫避光染色30 min，通過流式細胞術評估細胞周期變化。細胞增殖指數（PI）按照下列公式計算：PI（%）=（S期+G2期/M期）/（G0期/G1期+S期+G2期/M期）。以亞G1峰比值分析細胞凋亡情況。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測ERK、p-ERK、Cyclin D1、p21蛋白的表達 將EJ-1細胞（2×105）在60 mm培養皿中培養，使用無血清培養基饑餓24 h，用熊果苷（100 μg/mL）處理96 h。加入細胞裂解物及完整的蛋白酶抑制劑混合物提取蛋白。將樣品以12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，于含有0.5%Tween20的PBS中加入5%脫脂奶粉進行封閉，孵育20 min后，稀釋度為 1∶1 000的一抗（ERK、p-ERK、Cyclin D1、p21）4℃孵育過夜，室溫充分沖洗后使用二抗孵育2 h，顯影，最后用凝膠成像系統檢測。實驗重復3次。

1.6 統計方法 采用GraphPad Prism軟件進行數據分析。實驗數據以均數±標準差(-x±s)表示，組間比較采用Student t-檢驗法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同質量濃度熊果苷對EJ-1細胞增殖的影響 圖1結果顯示：不同質量濃度（10、20、50、100、500 μg/mL）熊果苷作用 EJ-1細胞24 h后，50、100 μg/mL熊果苷對EJ-1細胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），其中100 μg/mL增殖抑制作用最強。故選取100 μg/mL的熊果苷進行后續實驗的檢測。

2.2 不同作用時間熊果苷對EJ-1細胞增殖的影響 圖2結果顯示：以100 μg/mL熊果苷作用EJ-1細胞24、48、72、96 h后，以MTT法測定EJ-1細胞增殖能力。EJ-1細胞增殖抑制率分別為51.3%、71.9%、82.6%、92.8%。表明熊果苷以時間依賴性的方式抑制EJ-1細胞的增殖。

圖1 不同質量濃度熊果苷對EJ-1細胞增殖能力的影響Figure 1 The effect of different mass concentrations of arbutin on the proliferation capacity of EJ-1 cells(-x±s)

圖2 100 μg·mL-1熊果苷不同作用時間對EJ-1細胞增殖能力的影響Figure 2 The effect of arbutin at 100 μg·mL-1on the proliferation capacity of EJ-1 cells at different treatment time (-x±s)

2.3 熊果苷對EJ-1細胞周期及細胞凋亡的影響 采用流式細胞術觀察熊果苷對EJ-1細胞周期及細胞凋亡的影響。表1結果顯示：隨著時間的進展，EJ-1細胞中G0/G1期細胞百分比逐漸升高，G2/M期細胞百分比逐漸降低。熊果苷作用96 h的EJ-1細胞PI明顯降低，與處理24～48 h的細胞PI比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。表明熊果苷可干擾EJ-1細胞的周期進展，具有時間依賴性，將細胞阻滯于G2/M期。同時，隨著時間的進展，亞G1峰值逐漸升高，96 h時最為明顯（P＜0.05）。表明熊果苷可促進EJ-1細胞凋亡，且呈時間依賴性。

表1 不同作用時間熊果苷對EJ-1細胞周期的影響Table 1 The effect of arbutin on the cell cycle of EJ-1 cells at different treatment time （-x±s，p/%）

2.4 熊果苷對EJ-1細胞p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21蛋白的影響 以100 μg/mL熊果苷作用EJ-1細胞0、24、48、72、96 h后，采用Western blot法檢測細胞周期相關蛋白p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21蛋白的表達水平。圖3、表2結果顯示：與同組0 h比較，作用24、48、72、96 h后，p-ERK蛋白表達水平均降低（P＜0.05），呈逐漸下降后再升高的趨勢。ERK蛋白表達水平均降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。Cyclin D1蛋白表達水平均升高（P＜0.05），呈逐漸升高后再下降的趨勢。p21蛋白表達水平隨時間延長逐漸升高，于96 h差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 EJ-1細胞p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21凝膠電泳圖Figure 3 The gel electrophoresis image of p-ERK，ERK，Cyclin D1，and p21 in EJ-1 cells

表2 不同作用時間熊果苷對EJ-1細胞p-ERK、ERK、Cyclin D1、p21蛋白表達的影響Table 2 The effect of arbutin on the expression of p-ERK，ERK，Cyclin D1，and p21 of EJ-1 cells at different treatment time （-x±s，p）

3 討論

在亞洲，膀胱癌每年有15.3萬的新發膀胱癌病例和3.5萬人死亡；在我國，2015年新增膀胱癌患者人數估計為2.3萬人，死亡人數估計為1.1萬人[11，12]。膀胱癌可以分為非肌肉浸潤性腫瘤和肌肉浸潤性腫瘤2類[13]。盡管70%～80%的患者被診斷為非肌層浸潤性腫瘤，但是在這些患者中觀察到明顯的高復發率（50%～70%），而在復發病例中，15%的膀胱癌患者發展為肌肉浸潤性疾病[14，15]。非肌層浸潤性膀胱癌患者的5年生存率接近90%，而肌層浸潤性膀胱癌患者的5年生存率約為60%[16]，近80%的淋巴結轉移患者在頭5年內死亡[17]。由于多數針對晚期膀胱癌的西醫治療的臨床試驗效果有限，所以開發更安全有效的治療藥物十分必要。

研究表明，熊果苷可以作為天然分子結合受體與miRNA結合并參與其表達調控過程，影響細胞自身的增殖和凋亡行為[18]。本研究結果顯示：100 μg/mL熊果苷對EJ-1細胞增殖的抑制作用最佳，且呈時間依賴性。100 μg/mL熊果苷作用96 h的EJ-1細胞PI下降，與處理24～48 h的細胞PI比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。亞G1峰值逐漸升高，96 h時最為明顯（P＜0.05）。表明熊果苷可干擾EJ-1細胞的周期進展，具有時間依賴性，可將細胞阻滯于G2/M期，并促進細胞凋亡。

已知ERK蛋白信號傳導途徑在細胞增殖中起關鍵作用[19]，參與了細胞周期調控[20]。細胞周期蛋白Cyclin D1是通過G1期的細胞周期進展的限速和關鍵因子[21]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21也可以參與細胞周期調控[22]。p21的表達增加可能誘導細胞周期停滯和隨后的細胞生長抑制[23]。本研究結果顯示：與同組0 h比較，作用24、48、72、96 h后，p-ERK蛋白表達水平均降低（P＜0.05），呈逐漸下降后再升高的趨勢；ERK蛋白表達水平均降低，但差異無統計學意義（P＜0.05）；Cyclin D1蛋白表達水平均升高（P＜0.05），呈逐漸升高后再下降的趨勢；p21蛋白表達水平隨時間延長逐漸升高，于96 h差異有統計學意義（P＜0.05）。表明熊果苷處理膀胱癌EJ-1細胞后可抑制ERK蛋白的磷酸化進程。由于ERK通路是主要的促有絲分裂信號，因此，熊果苷對ERK信號通路途徑的滅活似乎對其抗增殖作用有直接的干擾，其具體作用環節還需進一步研究。

綜上所述，我們研究了熊果苷對膀胱癌EJ-1細胞的抗增殖作用及相關機制，研究結果表明熊果苷可抑制膀胱癌EJ-1細胞的增殖，其機制可能與抑制細胞周期相關蛋白ERK和p21蛋白的表達有關。本研究拓展了中藥提取物熊果苷的應用價值，也為臨床應用熊果苷治療膀胱癌奠定了基礎。