金翹片體內抗甲型H3N2流感病毒及禽流感病毒H9N2作用研究

張美義， 何家靖， 楊子峰， 楊兆麗， 楊家慶， 詹利之，曾慶慕， 馮麗玲， 李國橋， 朱宇同

（1.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州 510405；2.廣州醫科大學廣州呼吸道疾病研究所，廣東廣州 510000）

金翹片是由金銀花、連翹、牛蒡子、甘草等9味中藥組成的復方制劑，具有疏風解表、清熱解毒的功效。前期經體內研究[1]證實：金翹片具有顯著的抗甲型H1N1流感病毒作用，能夠明顯抑制H1N1流感病毒導致的小鼠肺指數升高，提高死亡保護率和生命延長率，降低肺組織的病毒載量，提高γ干擾素（γ-IFN）水平（P＜0.05或P＜0.01）。本研究進一步探討了金翹片對甲型H3N2流感病毒及禽流感病毒H9N2的作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 金翹片由廣州中醫藥大學青蒿研究中心藥學研究室提供，批號：070801、120501；給藥前用無菌蒸餾水配制成所需質量濃度。利巴韋林（Rib.），由廣東肇慶星湖生物化學制藥廠生產，批號：L051075。銀翹解毒片由北京同仁堂科技發展公司制藥廠生產，批號：0124432。阿司匹林腸溶片為湖南新匯制藥有限公司產品，批號：09115。羅通定為四川金藥師制藥有限公司產品，批號：090401。

1.2 動物 NIH小鼠，雌雄各半，體質量13～15 g，SPF級，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2008-0002。SD大鼠，雌雄不拘，體質量160～190 g，SPF級，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2008-0002。飼養環境：室溫（23±2）℃，相對濕度為（75±10）%，喂以標準鼠類塊料，自由飲用蒸餾水。

1.3 病毒株 甲型H3N2流感病毒鼠肺適應株，由中國藥品生物制品檢定所提供，經雞胚尿囊腔傳代增強毒力后，測定其半數致死量（LD50=10-3.50）（為20120717病毒液）。禽流感病毒H9N2鼠肺適應株，由華南農業大學獸醫學院藥理教研室提供，經雞尿胚囊腔傳代增強毒力后，以雞紅血細胞血凝來判斷其滴度，并測定半數致死量LD50為10-3.70。分裝封蓋，置-80℃冰箱凍存備用。本實驗主要工作在廣州中醫藥大學原蟲與病毒實驗室完成。

1.4 主要試劑與儀器 無水乙醚（廣州化學試劑廠）。JD200-3型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；T500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）。

1.5 動物分組[2]甲型H3N2流感病毒模型：將小鼠隨機分為正常對照組、病毒對照組、利巴韋林組（劑量為75 mg/kg）、金翹片組[070801與120501共2批，低、中、高劑量分別為0.610、1.220、2.440 g（生藥）/kg]，共9組，每組10只。利巴韋林組和金翹片不同劑量組給予相應劑量藥物，正常對照組、病毒對照組給予等體積蒸餾水。除正常對照組外，其他各組小鼠在乙醚輕度麻醉下，以15 LD50病毒液滴鼻感染，每只0.2 mL。于感染前1 d開始灌胃給藥，每天1次，每次0.2 mL/10 g（體質量），連續5 d。

禽流感病毒H9N2模型：將小鼠隨機分為正常對照組、病毒對照組、利巴韋林組（劑量為75 mg/kg）和金翹片組[劑量為0.30 g（生藥）/kg]共4組，每組6～9只。各組給藥方式同H3N2模型，其中以15 LD50病毒液滴鼻感染，每只0.05 mL。灌胃給藥每次0.1 mL/10 g（體質量），連續5 d。

1.6 金翹片對流感病毒感染小鼠胸腺的影響 給藥結束后，取出胸腺，稱質量，計算胸腺指數。胸腺指數（%）=胸腺質量（mg）/體質量（g）×100%。

1.7 金翹片對流感病毒感染小鼠肺病變的影響 給藥結束后第2天，禁食禁水4 h以上，稱體質量，處死，取出全肺，記錄病變程度；于生理鹽水中洗滌2次，用吸水紙吸干表面水分，稱肺質量，計算肺指數和肺指數抑制率。肺指數（%）=肺質量（g）/體質量（g）×100%。肺指數抑制率（%）=（病毒對照組肺指數均數-用藥組肺指數均數）/病毒對照組肺指數均數×100%。

1.8 金翹片的解熱、鎮痛、抗炎作用

1.8.1 對干酵母所致大鼠發熱的解熱作用[2]取大鼠60只，體質量160～190g，將大鼠隨機分為6組，即生理鹽水組、銀翹解毒片組[1.12 g（生藥）/kg]、金翹片組[低、中、高劑量分別為0.305、0.610、1.220 g（生藥）/kg]、阿司匹林組（0.1 g/kg），每組10只。致熱前各組大鼠禁食（不禁水）8 h，然后按前述劑量各組給藥1次。給藥后立即給予大鼠背部皮下注射20%酵母懸液10 mL/kg致熱，于致熱后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h各測大鼠體溫1次。

1.8.2 對小鼠熱板致痛的影響[2]采用小鼠熱板法，控制實驗溫度為18℃，熱板溫度為（55±0.5）℃。以小鼠放于熱板上后出現舔足所需時間作為痛閾值。取痛閾合格（5～30 s）雌性NIH小鼠72只隨機分為6組，即生理鹽水組、銀翹解毒片組[2.24 g（生藥）/kg]、金翹片組[低、中、高劑量分別為0.610、1.220、2.440 g（生藥）/kg]、羅通定組（30 mg/kg）。每組12只。測定用藥前、用藥后0、30、60、90 min的小鼠痛閾值。

1.8.3 對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響[2]取大鼠60只，體質量160～190 g，將大鼠隨機分為6組，即生理鹽水組、銀翹解毒片組[1.12 g（生藥）/kg]、金翹片組[低、中、高劑量分別為0.305、0.610、1.220 g（生藥）/kg]、阿司匹林組（0.1 g/kg），每組10只。以1%的角叉菜為致炎劑，分別在大鼠右后肢足跖皮下注射0.1 mL。致炎前測定各組大鼠右后跖的正常體積，致炎后0、1、2、3、4、5、6 h再測定各組大鼠右后跖的體積。記錄結果，按下式計算腫脹率：腫脹率（%）=[（致炎后足跖容積-致炎前足跖容積）/致炎前足跖容積]（100%。

1.9 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金翹片對甲型H3N2流感病毒感染鼠肺病變的抑制作用 表1～3結果顯示，在本次實驗條件下，病毒對照組肺指數為2.030，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），說明造模成功。利巴韋林肺指數抑制率為62.3%，具有明顯的抑制肺病變作用。2批金翹片（070801、120501）肺指數抑制率介于35.7%～54.3%，均具有明顯的抑制肺病變作用，量效關系明顯，且對小鼠體質量及胸腺均無明顯的抑制作用。

2.2 金翹片對禽流感病毒H9N2感染鼠肺病變的抑制作用 表4結果顯示，明金翹片對禽流感病毒H9N2具有較顯著的抑制作用。

表1 各組小鼠體質量變化情況比較Table 1 Comparison of the body mass of mice in various groups (-x±s)

表2 各組小鼠肺指數比較Table 2 Comparison of the lung index in mice of various groups

表3 各組小鼠胸腺指數比較Table 3 Comparison of the thymus index in mice of various groups (-x±s)

2.3 金翹片的解熱作用 表5結果表明，給藥后2 h金翹片明顯抑制大鼠體溫升高并持續至10 h（P＜0.05或P＜0.01），起效快，且持續時間長，而相同劑量的銀翹解毒片[1.22 g（生藥）/kg]僅在8～10 h表現較明顯的體溫抑制作用，且持續時間較短。

表4 各組小鼠肺指數比較Table 4 Comparison of the lung index in mice of various groups

2.4 金翹片的鎮痛作用 表6結果表明，給藥后金翹片能明顯提高小鼠痛閾值，明顯提高小鼠痛閾百分率（P＜0.05或P＜0.01），持續90 min，鎮痛作用強于同劑量銀翹解毒片（P＜0.05）。

2.5 金翹片的抗炎作用 表7結果表明，生藥劑量為0.610～1.220 g/kg的金翹片在致炎后3 h開始明顯抑制足跖腫脹（P＜0.05或P＜0.01），而銀翹解毒片在致炎后4 h開始發揮作用，強度弱于金翹片。

表5 金翹片對干酵母所致大鼠體溫的影響Table 5 Effect of Jinqiao Tablets on temperature alternation in rats induced by dry yeast (-x±s)

表6 金翹片對小鼠熱板法痛閾的影響Table 6 Effect of Jinqiao Tablets on hot-plate induced pain threshold in mice (-x±s)

表7 金翹片對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響Table 7 Effect of Jinqiao Tablets on carrageenan-induced pedal swelling in rats (-x±s)

3 討論

流感病毒的不斷流行主要在于病毒表面的2種糖蛋白抗原—血球凝集素（hemagglutinin，H）和神經氨酸酶（neuraminidase，N）的不斷進化。由于H和N抗原容易變化而產生新的亞型，此時人類往往對新亞型的免疫力不強而引起不同程度的流行。H3N2型流感1968年首次在香港發生[3]，但和H1N1、H7N9等類似，至今仍然是人群中流行的主要流感亞型。H9N2亞型禽流感病毒可以感染人，同時還是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等感染人的流感病毒的內部基因的供體[4]。

中醫藥治療病毒性感染疾病具有獨特優勢，不僅療效確切，耐藥性低，副作用和不良反應少，還有抑菌、抗病毒、解熱鎮痛、免疫調節等標本兼治的綜合功效[5]。中草藥抗流感病毒主要有2條途徑：直接滅活或抑制病毒和通過誘生干擾素或調節人體免疫功能而間接抗病毒[6]。由于前期的研究表明金翹片具有明顯的抗H1N1流感病毒作用，其作用明顯強于同等劑量下的銀翹解毒片及蓮花清瘟膠囊，甚至相當于化學藥達菲，這與復方中某些具有突出抗病毒作用的藥味及本復方成型采用的工藝是密切相關的。一般藥理研究表明，金翹片同時具有顯著的解熱、鎮痛、抗炎作用，這對于解除流感所致的發熱、咳嗽、咽痛等具有重要作用。文獻研究發現，目前已上市的蓮花清瘟膠囊（片/顆粒）、金花清感顆粒等抗感冒中藥復方尚未有關于抗禽流感病毒H9N2方面的研究報道。本研究結果顯示，本研究通過擴大試驗病毒種類，進一步證實了金翹片同時具有一定的抗甲型H3N2流感病毒及抗禽流感病毒H9N2作用。

（同等貢獻作者：李國橋，張美義，何家靖，楊兆麗，楊子峰）