化瘀祛痰方對高脂血癥大鼠心功能及脂質代謝的影響

杜瑩， 賈連群， 冷雪， 呂美君， 吳瑾， 陳麗娟

（遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室，遼寧沈陽 110032）

高脂血癥是臨床上多種常見疾病的重要危險因素，同時也是引發臨床高危險疾病，增加死亡率的獨立因素[1]。祖國醫學并無高脂血癥之名，但卻有“膏”、“脂”之說[2]，認為此類疾病多屬脾失健運，膏脂生化轉運失常，聚而為痰，日久壅滯營血，痰瘀互結，而成血脈痰瘀之患，常治以化瘀祛痰之法。課題組前期研究發現，以化瘀祛痰立法的化瘀祛痰方可以顯著改善高脂血癥大鼠肝臟脂質損傷情況[3]。而既往研究表明，動脈粥樣硬化是導致心力衰竭形成、發展和惡化的主要原因，高脂血癥導致脂質代謝異常是動脈粥樣斑塊形成的基礎[4]。因此，本研究擬通過建立高脂血癥大鼠模型，進一步探討化瘀祛痰方對其心臟功能及脂質代謝的影響?，F將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 健康SD大鼠40只，SPF級，體質量180～220 g，雌雄各半，購于遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。動物房溫度為（20.80±2.97）℃，空氣相對濕度為（47.30±15.31）%。高脂飼料質量分數配方：10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%蔗糖、81.3%基礎飼料。飼料由沈陽市于洪區前民動物飼料廠提供。

1.2 藥物 化瘀祛痰方為國家發明專利藥物（專利號：ZL200710010845.9），全方由黨參25 g、黃芪25 g、茯苓10 g、法半夏5 g、絞股藍15 g、石菖蒲5 g、川芎5 g、丹參5 g、郁金5 g組成，以上藥物均購于遼寧中醫藥大學附屬醫院。所有藥材浸泡1 h后，經武火煮沸，文火續煮20 min，過濾，重復煮3次，合并濾液，制成水煎劑，4℃冷藏；辛伐他汀片由魯南貝特制藥有限公司提供（批號：43160506）。

1.3 試劑與儀器 甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒由四川邁新生物技術有限公司提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供，批號：37B00150；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠試劑盒由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供，批號：37K00130；兔抗大鼠膽固醇酯轉運蛋白（CETP）、肝脂酶（HL）單克隆抗體由愛必信（上海）生物科技有限公司提供，批號分別為AB02271548G、YE1026W。全自動生化分析儀（日本東芝公司）；Vevo2100超高分辯率小動物超聲影像系統（加拿大VisualSonics公司）；FluorChem Q蛋白印跡成像和定量分析系統（美國Proteinsimple公司）。

1.4 動物分組、造模與藥物干預 大鼠適應性飼養1周后，將大鼠按隨機數字表分為正常組、模型組、化瘀祛痰組和辛伐他汀組，每組10只。正常組給予普通飼料，模型組、化瘀祛痰組和辛伐他汀組大鼠給予高脂飼料喂飼，共喂飼12周，復制高脂血癥模型[5]。造模結束后，按人和動物體表面積折算系數換算給藥劑量[6]，化瘀祛痰方組給予化瘀祛痰方藥（劑量為16.0 g·kg-1·d-1）灌胃，辛伐他汀組給予辛伐他汀（劑量為3.0 mg·kg-1·d-1）灌胃，日1次，正常組和模型組予等體積生理鹽水（8.0 mL·kg-1·d-1）灌胃，連續給藥30 d。

1.5 指標檢測與方法

1.5.1 心功能檢測 大鼠誘導麻醉后，將其鼻部置于鼻套中吸入體積分數2%異氟烷氣（異氟烷∶氧氣=2∶1），仰臥位固定。待翻正反射消失后，胸部予脫毛膏脫毛備皮，涂耦合劑，小動物超聲探頭（250 mHz）置于大鼠左前胸，連接超聲檢查儀，進行超聲檢查。測量左室收縮末期直徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室縮短分數（left ventricular fractional shortening fraction，LVFS）等變化情況。

1.5.2 血脂檢測 末次給藥結束后空腹12 h，于次日清晨麻醉，腹主動脈采血5 mL。靜置1～2 h，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，取上清液，4℃保存。全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量。

1.5.3 Western blot法檢測肝組織中CETP、HL蛋白表達 加入蛋白裂解液提取各組肝臟組織蛋白，利用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白進行定量。以60 μg蛋白/泳道上樣，經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜。加入CETP/HL及β-actin一抗，4℃封閉過夜。TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標記的二抗。按1∶1比例配制化學發光液，將膜放在曝光板上，膜上滴適量的發光液，應用全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統曝光分析圖片。數據結果以目標蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值比值（p）表示。

1.6 統計方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(-x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異（LSD）法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟功能變化情況 表1、圖1結果顯示，與正常組比較，模型組LVESD、LVEDD顯著增大，LVEF、LVFS顯著減小，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），表明模型組大鼠左心功能明顯降低。與模型組比較，化瘀祛痰組大鼠LVESD、LVEDD顯著縮小，LVEF、LVFS顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組大鼠LVEDD縮小，LVEF顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），LVESD亦縮小，LVFS亦升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心臟功能變化比較Table 1 Comparison of the cardiac function indexes in various groups (-x±s)

圖1 各組大鼠左心室M型超聲心動圖比較Figure 1 Comparison of the left ventricular M-type ultrasonic cardiogram in various groups

2.2 各組大鼠血脂情況 表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，化瘀祛痰組大鼠血清TG、TC水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低，差異均有統計學意義（P ＜ 0.01）。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of TG，TC，HDL-C and LDL-C in various groups[-x±s，c/（mmol·L-1）]

圖2 各組大鼠肝臟CETP、HL蛋白表達比較Figure 2 Comparison of the expression levels of CETP and HL in liver tissues of various groups

2.3 各組大鼠肝臟CETP、HL蛋白表達比較 圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肝臟CETP蛋白表達水平升高，HL蛋白表達水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，化瘀祛痰組和辛伐他汀組肝臟CETP蛋白表達水平降低，HL蛋白表達水平升高（均P＜0.05）。

3 討論

血脂異常多伴有多種心血管危險因素，心血管疾病的發生率和死亡率會隨著血清TC的下降而降低，而血清TC及TG的增加則會加劇動脈粥樣硬化的形成、發展，增加心力衰竭的發展及惡化的風險[7]。冠心病患者多因冠狀動脈粥樣硬化而致心肌組織纖維化，左室增厚，LVEDD增大，從而影響心臟收縮和舒張功能，故認為冠心病患者多存在心功能的改變[8]。然而冠心病早期并無明顯的心功能減退癥狀，往往受到人們的忽視，因此對于心功能減退如何早期發現并預防其發展至心衰是臨床中亟待解決的問題[9]。

中醫學認為，高脂血癥的發病機理以脾、肝、腎三臟功能失調為主，多因飲食不節或過食肥甘而傷脾，脾虛失運，津液內停，聚而生痰，由痰致瘀，故痰瘀互結而發病。正如《本草經疏》中記載：“飲啖過度，好食油面豬脂，濃厚膠固，以致脾氣不利，壅滯為患，皆痰所為?！碧岛宛鲋g存在著因果關系，貫穿高脂血癥的病程始終[10]，從“痰瘀同治”角度出發來防治高脂血癥有廣闊的前景。本研究所用的化瘀祛痰方為國家專利藥物，由黨參、黃芪、茯苓、法半夏、絞股藍、石菖蒲、川芎、丹參、郁金等組成，具有活血、化瘀、祛痰的作用，多用于痰瘀互結型的動脈粥樣硬化的治療，并在臨床上取得了滿意的療效[11]。本研究結果顯示，高脂血癥大鼠存在不同程度的血脂異常及心功能減退，化瘀祛痰方能顯著降低高脂血癥大鼠的TC、TG水平，縮小LVESD、LVEDD，升高LVEF及LVFS，說明化瘀祛痰方在降低血脂水平的同時，也改善了大鼠的心臟功能。

本課題組前期研究發現，化瘀祛痰方能夠從多個方面對高脂血癥大鼠肝臟脂質損傷起到保護作用[12，13]。本研究進一步發現，化瘀祛痰方能降低高脂血癥大鼠肝臟CETP、HL蛋白的表達。CETP與HL均是與心血管疾病密切相關的蛋白，它們都在脂質代謝和轉運過程中起重要作用。CETP能將膽固醇酯從HDL轉移到LDL-C和VLDL上，從而降低了HDL-C濃度，使CETP產生了致動脈粥樣硬化作用。HL能水解脂蛋白中的TG和磷脂，其主要功能是降低血脂水平，HL對調節血脂、防治動脈粥樣硬化有重要意義[14]。

目前，他汀類藥物具有降脂作用已經得到肯定，這類藥可通過競爭性、選擇性地抑制膽固醇及肝臟羥甲基戊二酰輔酶還原酶的合成，從而降低血漿中膽固醇含量，改善血液流變學指標水平，促使動脈粥樣硬化逆轉，改善心肌血循環，增強患者心功能[15]。本研究選用辛伐他汀作為陽性對照藥。研究發現，辛伐他汀在穩定降低血脂水平的同時，可以下調CETP蛋白表達，上調HL蛋白表達，還可縮小LVEDD，提升LVEF值，從而改善了心臟功能，而左室LVESD，雖有縮小趨勢，以及LVFS略有升高，但差異均無統計學意義。出現此結果考慮與樣本含量有限有關，有待擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，本研究以高脂血癥大鼠為研究對象，探討化瘀祛痰方對高脂血癥大鼠脂質代謝相關蛋白和心功能的影響。結果發現化瘀祛痰方既可降低血脂水平，也可改善高脂血癥大鼠的心臟功能，為化瘀祛痰方的治療范圍提供了一定的實驗依據。