外源NO對Ca(NO3)2脅迫下番茄葉片活性氧損傷的緩解效應*

孫德智 韓曉日 楊恒山 范 富 張慶國 彭 靖 蘇雅樂其其格

（1 內蒙古民族大學農學院，內蒙古通遼 028000）

（2 沈陽農業大學土地與環境學院，土肥資源高效利用國家工程實驗室，沈陽 110866）

在季節性或常年性覆蓋的高溫設施內，由于土壤長期得不到雨水淋洗，隨水分蒸發運移至土壤表層的鹽分逐漸積累，加之連作、高復種指數和過量施肥等多種原因導致的土壤次生鹽漬化問題日趨嚴重[1-2］。設施土壤次生鹽漬化已經成為當前設施栽培的主要限制性因素和設施農業生產可持續發展的嚴重障礙[2］。

與濱海、內陸鹽土的組分不同，設施次生鹽漬土壤的主要鹽分組成是：陽離子有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等，以Ca2+為主，約占陽離子總量的60%以上；陰離子有N、Cl-、S、HC等，以N為主，約占陰離子總量的67%～76%。可見，Ca(NO3)2的過量積累是設施次生鹽漬土壤的主要特征[1-2］。番茄（Lycopersicon esculentumMill.）是一種世界性蔬菜，具有產量高、營養豐富和生產效益好等特點，在國內外蔬菜設施栽培生產中具有舉足輕重的地位[3］。因此，研究番茄在Ca(NO3)2脅迫下的生理生態變化及其機制，對其高產、優質栽培及耐鹽品種選育鑒定具有極其重要的意義。

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是植物體內普遍存在的一種兼具水溶性和脂溶性、能夠自由穿梭于細胞膜之間的氣態活性物質。作為活躍的小分子信號，NO介導了植物諸多生長發育和生理代謝過程。如種子萌發、根和花粉管的生長、氣孔關閉、開花、細胞鐵穩態的維持和程序性細胞死亡等[4］。研究發現，NO還可通過S-亞硝基化過程參與調控幾乎所有信號通路，并與活性氧（ROS）相互依賴、相互影響，共同參與植物對高溫[5］、低溫[6］、水分[7］、UV-B輻射[8］、重金屬[9］和鹽漬[10］等多種非生物逆境脅迫應答的防御調控過程。目前，NO調節植物耐鹽的研究大多集中于對NaCl脅迫的探討，有關NO能否緩解Ca(NO3)2脅迫對蔬菜、特別是對番茄植株危害的研究鮮見報道。本課題組前期試驗中發現，Ca(NO3)2脅迫下，經NO噴施處理的番茄幼苗葉片光系統Ⅱ（PSⅡ）光化學活性顯著改善，過剩光能通過反應中心耗散份額的增加并未加劇光合機構的氧化損傷，這暗示葉肉組織內強化了ROS清除系統的運轉[2］。鑒于此，本研究進一步探討外源NO處理對Ca(NO3)2脅迫下番茄幼苗葉片ROS損傷、抗氧化酶活性變化及抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環的影響，旨在揭示NO緩解番茄葉片Ca(NO3)2脅迫傷害的機理，為利用化學誘抗劑緩解設施土壤次生鹽漬障礙提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

供試番茄品種為‘秦豐保冠’，種子由西安秦豐蔬菜研究所提供。

將籽粒飽滿、大小一致的種子進行浸種催芽（55 ℃溫水中浸泡3～4 h后放在鋪有濕潤紗布的培養皿內，置于29 ℃恒溫箱中）處理后，播種于裝有蛭石的塑料營養缽（直徑×高：10 cm×10 cm）中，每缽1株。在日光溫室內培育，待真葉展開后每2天澆1/8濃度霍格蘭（Hoagland）營養液1次，每缽澆50 mL，當幼苗普遍長至四葉一心時，挑選長勢較好且一致的植株栽植于水培箱（長×寬×高：60 cm×40 cm×20 cm）內，每箱定植6株，株行距均為15 cm，定植前用去離子水洗凈根部的育苗基質?；謴蜕L10 d后開始進行試驗處理。用1/4濃度Hoagland營養液栽培，利用充氣泵24 h不間斷補充營養液中氧氣，每3天更換1次營養液。

試驗設4 個處理：（1）1/4濃度Hoagland營養液栽培（CK）；（2）1/4濃度Hoagland營養液+100 μmol·L-1硝普鈉（SNP）（CS）；（3）含80 mmol·L-1Ca(NO3)2的1/4濃度Hoagland 營養液（N）；（4）含80 mmol·L-1Ca(NO3)2的1/4濃度Hoagland營養液+100 μmol·L-1SNP（NS），每處理重復3次。開始試驗后，CS和NS處理每天6:00和18:00進行葉面噴施SNP，噴液量以葉片正反兩面完全濕潤且無液體下滴為準；CK和N處理噴施等量的去離子水。Ca(NO3)2脅迫濃度、SNP噴葉濃度均根據預備試驗篩選確定：依據是Ca(NO3)2達到80 mmol·L-1時，番茄幼苗生長抑制程度在70%左右，同時各項形態指標數值的降低幾乎均達到了顯著水平；SNP處理預設了0、50、100、200、400、800 μmol·L-16個濃度，100 μmol·L-1SNP噴葉處理對幼苗的各項形態指標均有顯著提高。為防止鹽激，先將栽培營養液中含有的Ca(NO3)2濃度增加至40 mmol·L-1，1天后再將鹽濃度補充增至80 mmol·L-1（將固體Ca(NO3)2直接溶于1/4濃度Hoagland營養液中），此時定為Ca(NO3)2脅迫處理開始時間。在脅迫后的第6和12天，各處理選取6株分別測定上數第2片完全展開葉的凈光合速率，然后隨機拔出3株，摘下葉片，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存，用于其他各項生理生化指標的測定。

1.2 測定項目與方法

生長指標測定：第15天結束處理后，各處理取樣6株，用游標卡尺測量莖粗、用直尺測量株高，分離植株根、莖、葉后分別洗凈，用吸水紙吸干，并烘干至恒重，按‘（莖粗/株高）×全株干重100’計算壯苗指數。

葉綠素和光合速率測定：采用80%丙酮浸提法[11］測定葉綠素含量；采用便攜式光合儀（LI-6400XT，LI-COR公司，美國）測定光合速率，儀器使用開放式氣路、6400-02B LED-紅藍光源，光強設置為800 μmol·m-2·s-1，葉室溫度為（28±2）℃、CO2濃度為（360±20）μL·L-1。

活性氧和質膜過氧化水平測定：按照王愛國和羅廣華[12］方法測定的產生速率；H2O2含量參照林植芳等[13］方法測定；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[14］；電解質滲出率測定采用張憲政[15］的方法。

抗氧化酶活性測定：超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）還原法[14］；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚比色法[11］；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外吸收法[14］；抗壞血酸過氧化物酶（APX）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性參照Nakano和Asada[16］方法測定；谷胱甘肽還原酶（GR）活性按照Foyer和Halliwell[17］方法測定；單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性采用Hossain等[18］的方法測定。

非酶抗氧化物質含量測定：還原型抗壞血酸（AsA）和脫氫抗壞血酸（DHA）含量參照Arakawa等[19］方法測定；還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用Grif fi th[20］方法測定。

1.3 數據處理

用Excel 2003和Origin Pro 8.5軟件整理試驗數據和作圖，用 SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析，采用最小顯著差數（LSD）法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結 果

2.1 Ca(NO3)2脅迫下SNP對番茄生長的影響

生長受抑制、生物量降低是鹽脅迫下植物最敏感的生理響應。由表1可以看出，CK處理下，葉面噴施SNP對番茄幼苗生長無顯著影響。Ca(NO3)2脅迫15 d后，植株各生長參數（株高、莖粗、莖葉及根系生物量和壯苗指數）均顯著降低。與Ca(NO3)2脅迫處理相比，脅迫條件下葉面噴施SNP處理不同程度提高了番茄幼苗的上述生長指標，其中，莖葉和根系生物量及壯苗指數增幅顯著，3指標依次較Ca(NO3)2脅迫處理分別增加了17.16%、9.23%和23.35%。說明噴施外源NO能夠有效緩解Ca(NO3)2脅迫對番茄幼苗生長的抑制，促進幼苗生長。

表1 不同處理下番茄幼苗生長狀況Table 1 Growth of tomato seedlings under different treatment

2.2 Ca(NO3)2脅迫下SNP對番茄葉片葉綠素含量和凈光合速率的影響

如圖1所示，與CK相比，Ca(NO3)2脅迫處理顯著降低了番茄幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量和凈光合速率，且處理時間越長，降幅越大。Ca(NO3)2脅迫下，葉面噴施SNP處理不同程度緩解了番茄幼苗葉片上述光合生理指標的降低，處理6 d，各參數分別較Ca(NO3)2脅迫處理高出了0.79%、11.92%、3.74%和22.61%；處理12 d，各參數分別較Ca(NO3)2脅迫處理顯著高出了15.69%、10.19%、14.08%和56.06%。C K和C K條件下葉面噴施SN P處理（C S）的上述各指標變化不明顯，且兩處理間無顯著差異。

圖1 不同處理下番茄幼苗葉片葉綠素含量和凈光合速率Fig. 1 Chlorophyll content and net photosynthetic rate of tomato seedlings under different treatments

2.3 Ca(NO3)2脅迫下SNP對番茄葉片活性氧和質膜過氧化水平的影響

如圖2所示，番茄幼苗在Ca(NO3)2脅迫下，葉片O2

·-產生速率以及H2O2、MDA含量和電解質滲出率均顯著升高，且處理時間越長，升幅越大。與Ca(NO3)2脅迫處理相比，脅迫條件下葉面噴施SNP處理顯著抑制了幼苗葉片上述各指標的顯著升高，處理6 d，各指標分別較Ca(NO3)2脅迫處理降低20.40%、20.58%、29.39%和26.25%（P＜0.05）；處理12 d，各指標分別較Ca(NO3)2脅迫處理降低18.82%、20.15%、26.17%和29.49%（P＜0.05）。CK條件下，葉面噴施SNP對番茄幼苗葉片的上述各指標均無顯著影響。

圖2 Ca(NO3)2脅迫下硝普鈉對番茄幼苗葉片活性氧、丙二醛含量及電解質滲出率的影響Fig. 2 Effects of sodium nitroprusside on active oxygen, malondialdehyde (MDA) content and electrolyte leakage in tomato seeding leaves under Ca(NO3)2 stress

2.4 Ca(NO3)2脅迫下SNP對番茄幼苗葉片抗氧化系統相關酶活性的影響

番茄幼苗在Ca(NO3)2脅迫處理6 d時，葉片SOD、POD和CAT活性均較CK顯著升高；在脅迫處理12 d時，與CK相比，SOD活性顯著升高，POD活性變化不顯著，CAT活性顯著降低（圖3）。與Ca(NO3)2脅迫處理相比，脅迫條件下葉面噴施SNP處理顯著提高了番茄幼苗葉片SOD、POD和CAT活性，處理6 d，3指標依次較Ca(NO3)2脅迫處理高出了9.19%、10.28%和14.51%（P＜0.05）；處理12 d，各指標依次較Ca(NO3)2脅迫處理高出了48.96%、12.57%和35.33%（P＜0.05）。CK條件下，葉面噴施SNP對番茄幼苗葉片SOD、POD和CAT的活性無顯著影響。

圖3 Ca(NO3)2脅迫下硝普鈉對番茄幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 3 Effects of sodium nitroprusside on superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities in tomato seedling leaves under Ca(NO3)2 stress

番茄幼苗在Ca(NO3)2脅迫處理6 d時，與CK相比，葉片APX活性顯著升高，GR活性升幅不顯著；在脅迫處理12 d時，與CK相比，APX活性升幅不顯著，而GR活性卻顯著升高（圖4）。與Ca(NO3)2脅迫處理相比，脅迫條件下葉面噴施SNP處理顯著提高了番茄幼苗葉片APX和GR的活性，處理6 d，依次較Ca(NO3)2脅迫處理增加了27.73%和46.94%（P＜0.05）；處理12 d，依次較Ca(NO3)2脅迫處理增加了43.14%和24.24%（P＜0.05）。CK和CK條件下葉面噴施SNP處理的APX、GR活性變化不明顯，且兩處理間無顯著差異。

圖4 Ca(NO3)2脅迫下硝普鈉對番茄幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的影響Fig. 4 Effects of sodium nitroprusside on activities of ascorbate peroxidase (APX) and glutathione reductase (GR) in leaves of tomato seedlings under Ca(NO3)2 stress

如圖5所示，番茄幼苗在Ca(NO3)2脅迫處理的6 d和12 d，與CK相比，葉片DHAR活性顯著升高，且處理時間越長，升幅越大；MDHAR活性在6 d變化不顯著，在12 d顯著提高。Ca(NO3)2脅迫下，葉面噴施SNP顯著提高了番茄幼苗葉片的DHAR活性；對MDHAR活性的提高在6 d時不顯著，在12 d時達顯著水平，處理6 d，DHAR和MDHAR活性分別較Ca(NO3)2脅迫處理高出了43.32%和6.61%；處理12 d，DHAR和MDHAR活性分別較Ca(NO3)2脅迫處理提高了12.83%和25.32%（P＜0.05）。CK和CK條件下葉面噴施SNP處理的DHAR、MDHAR活性變化不明顯，且兩處理間無顯著差異。

圖5 Ca(NO3)2脅迫下硝普鈉對番茄幼苗葉片脫氫抗壞血酸還原酶和單脫氫抗壞血酸還原酶活性的影響Fig. 5 Effects of sodium nitroprusside on activities of dehydroascorbate reductase (DHAR) and monodehydroascorbate reductase(MDHAR) in leaves of tomato seedlings under Ca(NO3)2 stress

2.5 Ca(NO3)2脅迫下SNP對番茄幼苗葉片非酶抗氧化物質的影響

番茄幼苗在Ca(NO3)2脅迫處理6 d時，葉片A s A含量較C K無顯著變化；在脅迫處理12 d時，與CK相比，AsA含量顯著降低；同樣是在Ca(NO3)2脅迫處理6 d和12 d，DHA含量顯著升高，AsA/DHA值卻顯著降低，且處理時間越長，變幅越大（圖6）。Ca(NO3)2脅迫下，葉面噴施S N P顯著提高了番茄幼苗葉片AsA含量和AsA/DHA值，同時降低了DHA含量，處理6 d，AsA含量和AsA/DHA值分別升高了11.03%和23.88%（P＜0.05），DHA含量降低了10.53%（P＜0.05）；處理12 d，AsA含量和AsA/DHA值分別升高了40.73%和61.73%（P＜0.05），DHA含量降低了13.19%（P＜0.05）。CK條件下，葉面噴施SNP對番茄幼苗葉片AsA、DHA含量和AsA/DHA值無顯著影響。

圖6 Ca(NO3)2脅迫下硝普鈉對番茄幼苗葉片抗壞血酸、谷胱甘肽含量及其還原力的影響Fig. 6 Effects of sodium nitroprusside on contents of ascorbic acid (AsA, DHA) and glutathione (GSH, GSSG) and their reducing power (AsA/DHA, GSH/GSSG) in leaves of tomato seedlings under Ca(NO3)2 stress

如圖6所示，與CK相比，Ca(NO3)2脅迫處理的番茄幼苗葉片GSH含量在6 d時無顯著變化，在12 d時顯著降低。同樣是在Ca(NO3)2脅迫處理的6 d和12 d，GSSG含量顯著升高，GSH/GSSG值卻顯著降低，且處理時間越長，變幅越大。Ca(NO3)2脅迫下，葉面噴施SNP顯著提高了番茄幼苗葉片GSH含量和GSH/GSSG值，降低了GSSG含量，處理6 d，GSH含量和GSH/GSSG值分別升高了22.22%和47.37%（P＜0.05），GSH含量降低了17.13%（P＜0.05）；處理12 d，GSH含量和GSH/GSSG值分別升高了36.78%和82.76%（P＜0.05），GSSG含量降低了25.25%（P＜0.05）。CK條件下，葉面噴施SNP對番茄幼苗葉片GSH、GSSG含量和GSH/GSSG值無顯著影響。

3 討 論

盡管Ca2+和N是植物吸收鈣和氮素營養的主要形式，但生長介質中過量Ca2+和N的存在也會干擾植物正常的生理代謝，造成ROS過量積累，引發膜脂過氧化，并導致包括光合膜在內的整個生物膜系統遭到破壞，致使葉片光合作用受阻，植株生物積累量下降[1-2,21-23］。本試驗中，Ca(NO3)2脅迫處理的番茄幼苗葉片MDA含量和電解質滲透率顯著升高，葉綠素含量和凈光合速率顯著降低，進而阻礙了植株生長發育和壯苗的形成。Ca(NO3)2脅迫下，葉面噴施SNP處理的幼苗葉片MDA含量和電解質滲透率顯著降低、葉綠素含量和凈光合速率顯著升高，同時植株生物量和壯苗指數亦顯著升高，表明外源NO對Ca(NO3)2脅迫下番茄幼苗葉片膜脂過氧化和生長的抑制作用均具有緩解效應。

植物在長期適應環境的進化中，發展出了一整套酶促和非酶促抗氧化系統以抵御逆境脅迫產生氧化傷害[24］。SOD是這一系統內ROS清除的第一道防線，它能將歧化為O2和毒性相對較弱的H2O2，而H2O2則可在POD、CAT、AsA-GSH循環及其他抗氧化物質的協同作用下獲得清除[7,9,25-26］。Ca(NO3)2脅迫下，番茄[22］、黃瓜[27］和茄子[23］的嫁接苗之所以較自根苗具有更強的ROS清除能力，是因為嫁接苗具有更高的抗氧化酶活性水平。Li等[28］研究認為，在Ca(NO3)2脅迫下，應用南瓜砧木嫁接對黃瓜幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性提高的促進與這一措施激發了葉中依賴H2O2的NO的積累、誘導了上述抗氧化酶基因的表達有關。焦娟等[29］以0.1 mmol·L-1SNP處理受硝酸鹽脅迫的黃瓜幼苗，結果發現，植株葉片SOD、CAT和APX活性顯著升高，POD活性雖有所降低，但表征細胞膜脂過氧化程度的MDA含量卻顯著下降，相似的研究結果也出現在楊全勇等[30］對相同硝酸鹽及其與缺鎂復合脅迫的研究報道中。本試驗結果顯示，對Ca(NO3)2脅迫處理的番茄幼苗進行葉面噴施SNP處理后，葉片SOD、POD、CAT、APX活性均可獲得不同程度的提高，而的產生速率和H2O2含量卻顯著下降，表明外源NO處理可以通過提高抗氧化酶活性減少ROS的產生，進而增強了植株的抗（耐）鹽能力。這與杜長霞等[21］對黃瓜幼苗研究的結果一致。以往已有報道指出，通過誘導內源NO的合成，外源NO介導的植物ROS清除途徑有二：其一是促進內源NO直接對ROS的清除；其二是利用內源NO信號調控網絡增強編碼抗氧化酶基因的表達，通過酶促抗氧化反應強化對ROS的清除[10,31］。Ca(NO3)2脅迫下，外源NO對番茄幼苗葉片ROS清除能力提高的機制是否同時兼具上述兩種途徑尚待進一步驗證。

在APX催化下，AsA將H2O2還原成H2O后，最終被轉化成DHA。AsA含量及其還原力（AsA/DHA）與植物抗（耐）逆能力正相關[25］。GSH是一種能夠穩定細胞膜結構的重要抗氧劑，在AsAGSH循環中，它可作為電子供體將DHA還原成AsA，而自身被氧化成GSSG[26,32］。GSH含量及其還原力（GSH/GSSG）是激活植物抗性基因的信號之一[26］。有研究指出，相比AsA、GSH的絕對含量，AsA/DHA和GSH/GSSG值的變化更能反映出植物對逆境脅迫的適應[33］。本研究中，番茄幼苗在Ca(NO3)2脅迫第6 d，葉片AsA和GSH含量變化不顯著；在脅迫第12 d，AsA、GSH含量顯著降低，其原因可能與植株對Ca(NO3)2的應激適應有關。脅迫過程中DHA和GSSG含量持續顯著升高，AsA/DHA和GSH/GSSG值顯著降低，這可能與AsA、GSH參與了ROS的清除而被氧化成DHA和GSSG有關。Ca(NO3)2脅迫下，葉面噴施SNP處理在提高幼苗葉片AsA、GSH含量和AsA/DHA、GSH/GSSG值的同時，使DHA、GSSG含量降低，表明外源NO可通過提高AsA-GSH循環中抗氧化劑的含量及維持其較高的還原狀態來降低Ca(NO3)2脅迫對番茄幼苗葉片質膜造成的危害，從而起到了保護膜結構穩定的作用。

單脫氫抗壞血酸（MDHA）是AsA的初級氧化產物，它很不穩定，在MDHAR的作用下迅速還原成AsA，作為MDHA的歧化產物，DHA能在DHAR催化下重新生成AsA，而在此過程中，被氧化了的底物GSSG又可在GR的催化下重新還原成GSH[26,32］。可見，較高的MDHAR、DHAR、GR活性水平是確保AsA、GSH再生和維持AsA-GSH循環高效運轉的關鍵。Ahmad等[9］研究指出，通過對MDHAR、DHAR、GR等與AsA和GSH再生及AsA-GSH循環運轉相關的酶活性的保護，外源NO緩解了重金屬鎘脅迫對番茄幼苗造成氧化損傷，相似的研究結果也出現于Hasanuzzaman等[5］對小麥抵御高溫脅迫的報道中。在NaCl脅迫下，經SNP處理的黃瓜[34］和黑麥草[32］幼苗葉片MDHAR活性無顯著變化，對DHAR和GR活性的提升才是外源NO促進AsA、GSH再生及高效運轉AsA-GSH循環的真正原因。本研究結果顯示，Ca(NO3)2脅迫下經葉面噴施SNP處理，幼苗葉片DHAR、GR活性均可獲得不同程度的提升；MDHAR活性在第6天變化不顯著，在第12天顯著提升，表明外源NO可通過適時調控相關酶活性的提高而起到促進或維持AsA和GSH循環再生的作用。需要說明是，MDHAR催化MDHA向AsA再生的同時也關系到光合膜上光系統Ⅰ（PSⅠ）處O2.-的產生（當MDHA缺乏時，MDHAR在PSⅠ處被光還原時產生電子并傳遞給O2，而產生O2.-）[35］。本研究中，外源NO調節的MDHAR活性在第6天未發生顯著變化的原因可能與NO介導了PSⅠ的光保護有關，此推論的合理與否尚不明確，對此尚需深入研究。

4 結 論

通過對SOD、POD、CAT、APX、GR、MDHAR和DHAR活性升高的維持與促進，以及對AsA、GSH含量及其還原力（AsA/DHA、GSH/GSSG比值）的提高，噴施外源NO處理顯著減輕了Ca(NO3)2脅迫對番茄幼苗造成的氧化損傷，使葉片膜系統穩定性和光合功能得以顯著改善，植株生長抑制得到顯著緩解，進而增強番茄幼苗的耐鹽能力。