多腺毛煙草K326品種基因編輯材料的創制與分析

潘 陽，王召軍，李雪君，閆筱筱，張洪映，孫計平，崔 紅*

1.河南農業大學煙草學院，鄭州市文化路95號 450002

2.河南省農業科學院煙草研究所，河南省許昌市魏都區青梅路與永昌大道交叉口 461000

腺毛由植物表皮細胞分化而來，在植物抵御外界不良環境和次生代謝物質積累和利用中起重要作用［1］。煙草腺毛豐富，種類多樣。西柏烷二萜和糖酯化合物是煙草腺毛分泌物的主要成分，這些成分不僅是重要的香氣前體物質，而且對蚜蟲也具有明顯的趨避作用［2-4］。因此提高煙草腺毛密度是提高煙草抗性和改良煙葉品質的重要途徑之一。煙草腺毛密度受光照［5］、溫度［6］、水分［7］、土壤［8］、肥料［9-11］和生態環境［12］等多種條件的影響，但遺傳因素對煙草腺毛密度仍然起決定性作用。不同煙草類型［13］、品種［14-15］、葉位及葉片發育時期［16-17］的腺毛密度和分泌物含量與組分均有較大差異，在一定程度上影響煙葉的品質和風格。培育高腺毛密度、高分泌型的煙草品種是煙草常規育種的重要目標之一。豫煙11號是以煙草葉面分泌物為育種目標系統選育出的特香型烤煙品種，其葉面分泌物總量高于K326、紅大、翠碧1號、中煙100等烤煙品種，尤其賴柏當類二萜化合物含量顯著增加［13］。該品種的審定和推廣證明了腺毛分泌物含量增加對煙葉品質的顯著貢獻，而其“特香型”風格定位也體現了腺毛分泌物組分的改變對烤煙香氣風格所產生的影響。然而煙草遺傳背景狹窄，缺乏腺毛改良相關的遺傳材料，通過常規育種手段進行腺毛改良進展緩慢。采用基因編輯技術提高煙草腺毛密度，能在不改變分泌物組分的前提下提高分泌物含量，既保證了烤煙原有的香氣風格又提高了香氣量，是進行烤煙葉面化學改良的一條有效途徑。

植物B型細胞周期蛋白（B-type cyclins）參與細胞分裂過程中從G2向M期的轉換，在植物生長發育過程中起重要作用［18］。擬南芥CycB1;2基因在腺毛中的特異表達，可使單細胞腺毛轉變為叢生多細胞型腺毛［19］。番茄SlCycB2基因表達受到抑制后，多細胞非分泌型腺毛（Ⅲ型和V型）明顯增多，而分泌型腺毛（I型）消失［20-21］。NtCycB2在煙草中過表達及在番茄中異源表達均出現腺毛密度明顯減少的現象［22］。這些研究結果證明，NtCycB2基因對煙草腺毛的發生具有一定負向調控作用，可能成為利用基因編輯技術提高腺毛密度的理想靶點。但B型細胞周期蛋白在調控植物腺毛發生的同時，對植物生長發育也有多重影響，涉及根系發育［23］和種子萌發［24］等過程。在番茄中，SlCycB2基因的過表達可導致花器官異常、不育，抑制SlCycB2基因的表達對植株表型并無明顯影響［22］，但關于NtCycB2基因對煙株生長發育和物質積累的影響目前還未見報道。為此，以煙草品種K326為材料，通過基因編輯技術敲除NtCycB2基因后創制了高腺毛密度的K326純合材料（HK326），并分析了NtCycB2基因敲除對煙株生長發育、葉面化學成分、烤后煙中性香氣物質的影響，旨在探索NtCycB2基因在煙草葉面化學成分定向調控及煙草品種分子改良中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為煙草品種K326，無菌苗于光照培養箱中培養，培養條件為溫度25℃、相對濕度60%，光周期16 h光/8 h暗。大田試驗于2018年進行，地點設置在河南省許昌市河南省農科院煙草研究所試驗田，于5月8日移栽，按照優質烤煙栽培規程進行田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建

根據已發表的煙草NtCycB2蛋白序列［22］，在K326基因組序列數據庫（https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome）中 進 行 Blast比對，獲得NtCycB2基因的兩個拷貝（Nitab4.5_0014697g0010.1和 Nitab4.5_0012062g0010.1）。借助CRISPR2在線軟件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/），依據其同源序列設計 gRNA：GTGATCAACCACCCACAAG，合成二聚體后連入CRISPR-Cas9載體，并獲得NtCycB2基因敲除載體。載體中gRNA由擬南芥U6啟動子啟動，篩選標記為潮霉素。

1.2.2 遺傳轉化

采用葉盤轉化法進行煙草遺傳轉化［25］。將上述構建得到的NtCycB2基因敲除載體轉入農桿菌GV3101菌株，于YEB培養基中培養至菌液OD600值為0.4～0.6，侵染預培養2 d的K326葉圓片8 min，黑暗條件下共培養2 d后轉入篩選培養基［MS培養基 +0.15 mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthalene acetic acid，NAA）+1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）+8 mg/L 潮 霉 素 B（Hygromycin B，Hyg）+50 mg/L 頭 孢 噻 肟 鈉（Cefotaxime sodium，CTX）］上分化，待長出不定芽后轉入生根培養基（MS培養基+0.15 mg/L NAA+8 mg/L Hyg）繼續培養，以獲得抗性植株。

1.2.3 分子鑒定

采用CTAB法提取抗性植株的基因組DNA，在gRNA附近設計檢測引物（F1：ATGAGCCGAAG AAATGGAAA，R1：CAACATCAAGCAAACAAGT AC），對T0代幼苗中NtCycB2基因gRNA區域進行擴增。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；38個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收，連入pMD19-T載體，送金唯智公司測序，以鑒定其突變情況。得到的陽性植株自交留種，并獲得T1代煙草種子。

煙草T1代種子采用漂浮育苗，待煙苗生長至三葉一心時，剪取T1代單株葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。利用潮霉素抗性基因擴增引物（F2：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT，R2：CTGCT CCATACAAGCCAACCAC）對T1代單株進行鑒定，并篩選出無轉基因篩選標記的單株。

1.2.4 農藝性狀調查

2018年3月將K326及去載體的NtCycB2基因敲除株系按照行業標準［26］進行育苗，5月8日移栽至河南省農科院煙草研究所試驗田，并按照標準方法［27］進行大田種植與管理，保證各株系在相同條件下正常生長。依照煙草行業標準方法［28］在煙株現蕾期進行農藝性狀指標的測量。

1.2.5 腺毛形態學分析

于旺長期取煙株上、中、下部的葉片進行化學染色、腺毛形態觀察及密度統計。實驗操作參考婁亞楠等［29］的方法，將葉片置于0.2%（W/V）的羅丹明B水溶液中浸染30 min，染色結束后用蒸餾水漂洗3次，沖洗掉未結合的染料。用濾紙吸干葉片表面水分后，置于超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）下進行腺毛觀察，并在葉片上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛密度的統計。

1.2.6 葉面化學成分分析

煙株打頂4周后取中部葉片（第12葉位），在二氯甲烷溶液中浸提。浸提液加入1 mL內標（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇的混合溶液）后過濾，在旋轉蒸發儀中濃縮后，在氮氣保護下將溶劑吹干。加入500 μL 1∶1（V∶V）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和N,O-雙三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA），75℃水浴中進行衍生化反應60 min，然后加入N,O-雙乙酰胺和吡啶各125 μL。采取GC/MS分析儀（美國Agilent公司，色譜儀型號HP-5890，質譜儀型號vc-70SE）進行樣品化學成分的定性和定量分析，色譜參數檢測參考王霄龍等［30］的方法。

1.2.7 中性香氣物質成分分析

選取烤后中部煙葉，研磨，用孔徑0.25 mm過濾篩過濾。稱取10 g煙樣置于500 mL圓底燒瓶中，并依次加入1 g檸檬酸和350 mL蒸餾水。另取40 mL二氯甲烷置于250 mL圓底燒瓶中并加入500 μL內標（硝基苯）。兩個圓底燒瓶聯通后同時加熱蒸餾萃取，收集250 mL燒瓶中有機相，加入10 g左右無水硫酸鈉搖勻至溶液澄清，水浴濃縮有機相至1 mL左右。所得樣品采用GC/MS聯用儀（美國Agilent公司 HP5890Ⅱ-5972）進行定性分析，參考邸慧慧等［31］的方法設定色譜參數。

1.2.8 數據處理

所有實驗均分別進行3次獨立測定，獲得數據采用SPSS 17軟件進行單因素方差分析及最小顯著差法多重比較，用Excel 2013軟件進行圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 多腺毛K326的創制和篩選

采用農桿菌介導法將攜帶NtCycB2基因敲除載體的GV3101菌株轉化煙草K326，獲得了23株耐受潮霉素的陽性植株。表型鑒定發現，大部分陽性植株在形態上與對照沒有明顯差異，但其中1個單株腺毛濃密，整株呈毛茸狀（圖1B），被命名為多腺毛K326（Hairy K326，HK326）。

圖1 HK326材料的創制Fig.1 Screening of HK326 line

HK326在T0代產生多腺毛表型，可能是NtCycB2的純合突變所致。為驗證這一推測，利用特異引物對HK326的gRNA區域進行擴增和PCR產物測序鑒定。結果發現，HK326中NtCycB2基因在gRNA區出現套峰（雙峰），說明HK326中NtCycB2基因已經發生了編輯，但并未純合（圖2A）?？紤]到K326中存在兩個NtCycB2基因拷貝，因此HK326中這種雜合狀態也可能是由于兩個拷貝發生了不同突變造成的。為此，進一步對HK326中NtCycB2基因進行了單克隆測序，在測序的10個單克隆中總共檢測到兩種類型的突變體，分別缺失了4 bp（同時還發生了1個C/T堿基突變）和7 bp（圖2B），但并沒有檢測到野生型序列，說明HK326中NtCycB2基因兩個拷貝的突變都已經純合。

為獲得無轉基因元件的敲除植株，將HK326自交繁種，利用潮霉素抗性基因篩選引物對HK326 T1代幼苗進行單株鑒定，結果如圖2C所示。在所檢測的80個單株中，有23株沒有擴增出潮霉素抗性基因片段，去載體單株的比例為28.8%。χ2檢測表明，含載體與去載體單株數量符合3∶1的比例，說明敲除載體在HK326基因組中為單拷貝插入。

圖2 HK326材料的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of HK326

2.2 K326和HK326農藝性狀的比較

為比較NtCycB2基因敲除對煙株生長發育的影響，將去載體后的HK326敲除植株與K326對照在河南省農業科學院煙草研究所試驗田進行種植。農藝性狀指標調查結果見表1?？梢钥闯?，與對照K326相比，HK326在株高和節距上表現出顯著差異，而在莖圍、最大葉長、最大葉寬和葉片數上HK326略高于對照K326。總體來看，HK326敲除植株生長勢強于對照K326。

2.3 K326和HK326的腺毛密度比較

在煙株現蕾期分別對K326和HK326上部葉（第16葉位）、中部葉（第8葉位）和下部葉（第4葉位）進行葉面腺毛形態觀察和密度統計，結果見表2和圖3。可以看出，HK326與對照K326的葉面腺毛均由長柄分泌型、短柄分泌型和非分泌型3種類型組成，且均以長柄分泌型為主；隨著葉片的生長發育，腺毛密度表現出逐漸減少的趨勢，但腺毛類型保持不變。HK326與對照相比，腺毛密度增加，尤其是在上部葉中表現更為明顯。除了非分泌型腺毛外，長柄分泌型和短柄分泌型均增加顯著，同時長柄分泌型腺毛出現分枝現象，腺毛總數為對照的3倍。羅丹明B可與糖酯結合使其染色，根據染色深淺可以判斷腺毛分泌能力的強弱，從圖3中可以看出，長柄分泌型腺毛著色程度大于短柄和非分泌型腺毛，表明其碳水化合物含量豐富；HK326腺毛不僅著色比對照深，而且腺頭飽滿，發育完善，具有旺盛的物質合成和分泌能力。

表1 K326和HK326農藝性狀調查結果①Tab.1 Agronomic traits of K326 and HK326

表2 K326和HK326各類腺毛的密度①Tab.2 Density of trichomes of K326 and HK326 （根/mm2）

A.長柄分泌型腺毛；B.短柄分泌型腺毛；C.非分泌型腺毛；D.長柄分枝腺毛（200×）

2.4 K326和HK326的二萜化合物分析

圖4 K326和HK326葉面二萜化合物的含量Fig.4 Diterpenes contents in K326 and HK326

二萜化合物作為腺毛分泌物的主要成分，不僅是重要的香氣前體物質，也對煙株抗性有重要影響［2,32］。為明確NtCycB2基因敲除對煙草二萜化合物組分和含量的影響，利用二氯甲烷萃取葉面化學成分并進行GC/MS檢測，結果見圖4?？梢钥闯?，HK326及對照的二萜化合物組成基本一致，均由西柏三烯一醇、西柏三烯二醇、西柏三烯二醇同分異構體組成，但含量變化較大。其中，HK326的西柏三烯一醇含量比對照提高72.09%；西柏三烯二醇比對照提高214.01%；西柏三烯二醇同分異構體比對照提高213.10%；從總量上看，HK326為151.01 μg/cm2，對照 K326 為 48.3 μg/cm2，提高 212.65%，可見HK326的二萜化合物含量遠高于K326。

2.5 K326和HK326烤后煙葉中性香氣成分分析

為比較NtCycB2基因敲除對烤后煙葉中性香氣成分和含量的影響，對K326、HK326烤后煙葉的中性香氣成分進行提取分析，結果見表3。

從表3可以看出，敲除株系HK326中性香氣物質含量均高于對照K326，其中苯丙氨酸類物質含量比K326提高36.5%；棕色化產物類含量提高11%；類西柏烷類物質含量提高39.3%；類胡蘿卜素類物質含量略高于對照K326；新植二烯含量提高59%?？梢?，NtCycB2基因敲除植株中性香氣成分總量明顯高于對照。

表3 K326和HK326中性香氣成分含量Tab.3 Contents of neutral aroma components in K326 and HK326

3 結論

通過基因編輯技術獲得了NtCycB2基因敲除且不存在任何轉基因元件的K326定向改良材料HK326，該材料腺毛濃密，尤其是長柄分泌型腺毛密度顯著提高。田間試驗顯示，HK326植株發育良好且生長旺盛。成熟期煙葉葉面化學成分分析表明，HK326腺毛分泌物含量顯著提高，主要化合物西柏三烯二醇含量為對照的近3倍。在烤后煙葉中西柏烷類香氣成分茄酮含量明顯增加，其他中性香氣成分也有不同程度增加，其中，新植二烯含量增加幅度較大?？梢姡跓煵葜星贸齆tCycB2基因可以增加分泌型腺毛密度，有利于腺毛分泌物積累和中性香氣成分含量的提高，在煙草葉面化學改良中具有較大應用潛力。