利用VIGS技術研究NtbHLH93基因在煙草甾醇代謝中的功能

武明珠，劉瑞霞，王 中，鄭慶霞，張劍鋒，李澤鋒，謝小東，魏 攀，李 鋒，羅朝鵬，曹培健，楊 軍*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

2.鄭州師范學院，鄭州市惠濟區英才街6號 450044

轉錄因子bHLH（Basic/helix-loop-helix，堿性/螺旋-環-螺旋）廣泛存在于生物體內，是真核生物中一類擁有眾多成員的重要轉錄因子。bHLH轉錄因子的作用廣泛，主要參與調控植物的生長發育、抗逆性、次生代謝過程［1-3］；參與調控動物的神經發育、肌肉發生、心臟發育等過程［4-5］；參與調控酵母的磷吸收和糖酵解過程［6］。

bHLH轉錄因子一般具有典型的螺旋-環-螺旋結構（Helix-loop-helix,HLH）。HLH區域大約由40個氨基酸組成，位于bHLH結構域的C端，含有既親水又親脂的α-螺旋（α-Helix）。兩個α-螺旋之間被不同長度的連接區（Loop）分開，形成螺旋-環-螺旋結構。bHLH轉錄因子家族成員的堿性區域（Basic region）位于bHLH結構域的N端并與HLH基序相鄰，由10～15個氨基酸組成，其中包括6個共有氨基酸殘基，該區域主要與DNA結合。同一個bHLH轉錄因子的兩個α-螺旋或不同bHLH轉錄因子α-螺旋之間可以相互作用，形成同源或異源二聚體，從而與靶基因啟動子的不同部位結合，對基因的轉錄發揮調控作用［7］。

目前，擬南芥和水稻中分別預測到158個和173個bHLH轉錄因子，并且把bHLH基因家族分為26個亞類。Li等［8］發現在水稻和擬南芥中，有72個bHLH基因在根、莖、葉和花中都有表達。其中，10個在根部特異表達，1個在莖部特異表達，9個在葉片中特異表達，30個在花和種子中特異表達。bHLH轉錄因子普遍表達的特點與其廣泛的生物學功能相對應。擬南芥AtbHLH93轉錄因子可以調控擬南芥在短日照情況下的生長發育和開花時間，GUS染色發現AtbHLH93基因主要在擬南芥幼苗的葉脈及根冠中表達［9］。Feldman 等［10］研究發現AtbHLH93還可調控擬南芥甾醇類和異戊二烯類物質的合成代謝，突變體bhlh93和野生型相比，突變體中甾醇類物質含量顯著下降，其中豆甾醇的含量下降最多。

煙草中的甾醇類物質主要有膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等［11］，霉變煙葉中還可能含有麥角甾醇［12］。植物甾醇在一定溫度下裂解均能產生稠環芳烴類化合物（PAHs）［13-14］。含有大量甾醇的煙草己烷萃取物是卷煙煙氣PAHs的主要前體物，卷煙煙氣中61%的苯并[a]芘（B[a]P）由它裂解產生［9］。豆甾醇在750℃下熱解可以生成B[a]P［11,15］，在豆甾醇裂解過程中，可能甾醇骨架的一系列單分子反應后形成了菲、蒽等PAHs，而菲、蒽等PAHs的形成依賴于甾醇多環骨架［16-17］。PAHs是最早發現的具有“致癌、致畸、致基因突變”的有毒物質［18］。降低煙草中甾醇含量，可降低煙氣中PAHs的含量。前期實驗中克隆到栽培煙草紅花大金元NtbHLH93基因，發現其與擬南芥AtbHLH93基因序列高度相似［19］。為此，對NtbHLH93基因的沉默植株進行分析，旨在解析NtbHLH93在煙草甾醇合成中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本氏煙草（Nicotianabenthamiana）種子經10%NaClO消毒后，種植于MS培養基中。成苗期進行移栽后，種植于國家煙草基因研究中心溫室。

Fast High Fidelity Polymerase高保真酶購于北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒、反轉錄試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞、pMD19-T載體均購于寶生物工程（大連）有限公司；連接試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；MS培養基購于美國Sigma-Aldrich公司；SYBR Premix Ex TaqTM購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為國產分析純。所用引物和產物的測序均由北京華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 pTRV2重組載體的構建

根據NtbHLH93基因的全長序列，設計引物用于構建pTRV2重組載體。正向引物：5'-TACACCAT GGGAACATTGAATCGTCCAG-3'，反向引物：5'-TCA TGAGCTCCTCTTTGTAATTTCCCAG-3'。分別在兩條引物上添加NcoⅠ和SacⅠ酶切位點和相應的保護堿基。PCR程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環；72℃延伸10 min；4℃保溫。PCR產物經酶切回收后連接到pTRV2空載體上，4℃過夜。連接載體轉化感受態細胞DH5α后培養過夜，挑取白色單菌落，37℃搖床培養12 h（200 r/min）。以菌液為模板進行PCR，驗證是否為陽性克隆。對含有目的片段的重組質粒進行雙酶切驗證和測序。

1.3 農桿菌的轉化

農桿菌轉化參照魏攀等［20］的方法。八氫番茄紅素去飽和酶（PDS）基因為農桿菌侵染的報告基因。將 VIGS質粒pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS和pTRV2-NtbHLH93通過凍融法轉入農桿菌菌株EHA105中，經菌落PCR驗證后，將陽性菌落接種到LB培養基中28℃過夜培養。LB培養基含有50 mg/L卡那霉素、25 mg/L利福霉素、20 μmol/L乙酰丁香酮（AS）及10 mmol/L 2-N-嗎啉基乙磺酸（MES）。菌液4 000 r/min離心5 min后，棄上清液。用 10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS、10 mmol/L MES配制侵染緩沖液，再用侵染緩沖液重懸菌體，將菌液稀釋至OD600為1.0左右。以本氏煙草為侵染對象，注射生理鹽水的煙草為空白對照（Con），陰性和陽性對照分別為注射pTRV2和pTRV2-PDS質粒的農桿菌，實驗組為注射pTRV2-NtbHLH93質粒的農桿菌。將含質粒pTRV1和pTRV2，pTRV1和pTRV2-PDS，pTRV1和pTRV2-NtbHLH93的農桿菌按1∶1的比例進行混合，用無菌注射器將農桿菌注入本氏煙草下部葉片中。

1.4 甾醇含量的測定

用GC-MS/MS檢測轉基因煙草中甾醇代謝物（膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等）含量的變化，每個樣品3次生物學重復。樣品前處理及分析：稱取凍干煙葉樣品50 mg，加1.5 mL正己烷、30 μL內標（10 ng/mL 5α-膽甾烷），渦旋6 s后室溫超聲提取20 min。將提取液靜置15 min，6 000 r/min離心5 min。取500 μL上清液至1.5 mL進樣瓶中，氮氣吹干后加入50 μLN-三甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺（MSTFA）。在37℃下反應50 min后，進行GC-MS/MS分析。氣相色譜條件：

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣量：1.0 μL；分流比：10∶1；進樣口溫度：280 ℃；載氣：He；流速：1 mL/min；升溫程序：60 ℃（20 min）。離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；離子源：EI源；采集模式：選擇離子監測（SRM）。

選擇特征離子對甾醇化合物進行定量：根據鮮煙葉中主要甾醇化合物的結構特征離子，選擇甾醇化合物的定量離子，分別對各種甾醇化合物進行定量分析，每個化合物同時選擇2～3個離子碎片進行輔助定量。根據特征離子峰面積與內標峰面積比值進行絕對定量。

1.5 熒光定量PCR

根據NtbHLH93、Niben101Scf06249g03002.1和Niben101Scf06249g03002.1基因序列設計qPCR引物。NtbHLH93上游引物：5'-CACAGGTTGCGTGAA GATC-3'，下游引物：5'-GAGGGTTTCTGACAAGTG C-3'；Niben101Scf06249g03002.1上 游 引 物 ：5'-GGCACAGTCACCCACAAA-3'，下游引物：5'-ATCC CTTCGCCTGAACAT-3'；Niben101Scf06249g03002.1上游引物：5'-GCACCGTCACTCACAAAG-3'，下游引物：5'-CTGCTGCATCACCAACTA-3'。煙草26SrRNA為內參基因，上游引物：5'-GAAGAAGGTCCC AAGGGTTC-3'；下游引物：5'-TCTCCCTTTAACAC CAACGG-3'。用FluorescentQuantitativePCRDetector（美國BIO-RAD公司）進行qPCR。

在冰上配制20μL的反應體系：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，30 ng/μL cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。進行3次獨立生物學重復，以不加模板的反應為陰性對照。qPCR反應程序：預變性94℃30 s；94℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環。反應結束后，根據得到的CT值，用 2-△△CT方法計算相對表達量［21］。經26S rRNA基因標準化后，設相同處理時間下對照的相對表達量為1，基因的相對表達量則為該基因與對照處理的比值。

1.6 轉錄組測序及數據分析

取VIGS誘導的基因沉默煙株和對照煙株（移栽4周后的本氏煙草，每個處理3個生物學重復）葉片，液氮速凍后，置于泡沫箱中用柱狀干冰運輸至金唯智生物科技（北京）有限公司，進行轉錄組測序。轉錄組數據經過簡單拼接，用de novo生物信息學軟件進行組裝。組裝后的數據使用NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和中國煙草基因組數據庫（V3.0）進行比對分析，選取表達差異倍數≥2的基因。使用blast2 go軟件進行GO功能分析。

1.7 數據處理

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析，選擇Duncan’s測驗（P＜0.05）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 NtbHLH93基因的載體構建

根據已克隆到的NtbHLH93基因全長序列設計VIGS引物，并進行PCR擴增。對PCR擴增產物進行驗證，發現擴增條帶長度在500 bp左右（圖1a）。將PCR產物連接到PTRV2空載體上，對pTRV2-NtbHLH93重組載體進行雙酶切，發現酶切產物長度在500 bp左右（圖1b）。對重組質粒進行測序，發現插入片段的序列與NtbHLH93基因的編碼序列一致。

2.2 農桿菌侵染結果

由圖2可知，本氏煙草在注入pTRV2（陰性對照）農桿菌10 d后，其表型和空白對照（Con）沒有明顯差異。而注入pTRV2-PDS（陽性對照）農桿菌10 d后，新長出的葉片出現明顯的白化癥狀，表明PDS基因被沉默，同時也表明農桿菌的侵染效率較高。pTRV2-NtbHLH93農桿菌侵染煙草后，煙株也出現明顯的白化癥狀，說明NtbHLH93基因可能影響煙株中葉綠素的合成。

M1.Marker 2000 1,2.PCR擴增產物 M2.Marker 10 000 3,4.pTRV2-NtbHLH93重組載體雙酶切產物 a.NtbHLH93基因的PCR電泳圖 b.pTRV2-NtbHLH93重組載體雙酶切的PCR電泳圖

圖2 農桿菌侵染本氏煙草10 d后的煙株表型Fig.2 Phenotype of tobacco seedlings on the 10th day after infection by Agrobacterium tumefaciens

2.3 農桿菌侵染后NtbHLH93基因的表達

接種兩周后，選取6株被pTRV2-NtbHLH93農桿菌侵染煙草的上部葉用于檢測NtbHLH93基因的表達。由圖3可知，在空白對照（Con）和注射pTRV2空載體的煙株中，NtbHLH93基因的表達差異不顯著。但是在注射pTRV2-NtbHLH93載體的煙株（R1～R6）中，NtbHLH93基因的表達量明顯下降，與對照（Con）相比表達量平均降低46.3%。

2.4 NtbHLH93基因對甾醇含量的影響

圖3NtbHLH93基因的qPCR檢測結果Fig.3 qPCR result of NtbHLH93

表1 甾醇含量的測定①Tab.1 Determination of sterol content （μg·g-1）

測定了對照（Con）及注射pTRV2-NtbHLH93煙株（R4株系）中的總甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇及羊毛甾醇含量（表1），發現注射pTRV2-NtbHLH93煙株中的總甾醇、豆甾醇、膽固醇和β-谷甾醇含量明顯下降。與對照（Con）相比，分別降低17.97%、21.48%、14.02%和9.09%。其他種類甾醇的含量沒有明顯變化。

2.5 NtbHLH93基因對煙草葉綠素合成的影響

下調NtbHLH93基因后，煙葉出現了明顯的白化癥狀。轉錄組測序結果（表2）表明，在265個差異表達的基因中，有44個與葉綠素合成相關的基因下調表達：①與捕光色素蛋白復合體相關的基因有25個，其中，與捕光色素蛋白復合體Ⅰ相關的基因有9個，與捕光色素蛋白復合體Ⅱ相關的基因有16個；②與光合系統相關的基因有19個，其中，與光合系統Ⅰ相關的基因有11個，與光合系統Ⅱ相關的基因有8個。以上結果表明NtbHLH93基因不僅影響甾醇類物質的合成，還影響葉綠素的合成。

2.6GO分析

分析對照和NtbHLH93基因表達量下調煙株的轉錄組數據，發現一些與生物學過程、分子功能、細胞組分相關的差異表達基因。其中，與生物學過程相關的基因最多，分子功能次之，細胞組分最少（圖4）。生物學過程中，與代謝過程及細胞過程相關的基因最多，分別占生物學過程總基因數量的62.5%和54.4%。分子功能中，與催化、結合及結構分子相關的基因最多，分別占分子功能總基因數量的22.4%、23.6%和21.2%。細胞過程中，與細胞、細胞組分、大分子復合物相關的基因最多，分別占細胞過程總基因數量的49.4%、49.4%和24.3%。

表2 pTRV2-NtbHLH93煙株中與葉綠素合成相關的差異表達基因Tab.2 Differentially expressed genes related to chlorophyll synthesis in pTRV2-NtbHLH93 tobacco seedlings

圖4 差異表達基因的GO分析Fig.4 GO analysis of differentially expressed genes

2.7KEGG代謝通路分析

通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫來分析轉錄組數據中差異表達的基因，發現了一些基因參與萜類化合物的生物合成。在MEP（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，2-C-甲基-D-赤蘚糖-4-磷酸）代謝中，有2個基因（Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1）在NtbHLH93沉默植株（R4株系）中分別上調了2.67和2.95倍。進一步通過qPCR驗證，發現與Con對照相比，這兩個基因分別上升了3.81和4.23倍（圖5）。Niben101Scf00063g13014.1和Niben101S cf06249g03002.1與GGPPS基因的序列高度相似，推測當甾醇合成通路受阻時，MEP代謝通路中的GGPPS基因表達上調。

圖5 NtbHLH93下調對Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1表達的影響Fig.5 Effects of downregulated NtbHLH93 on Niben101Scf00063g13014.1 and Niben101Scf06249g03002.1 expressions

3 討論

甾醇是卷煙煙氣PAHs的主要前體物［9,11,15］。Feldman［10］發現擬南芥轉錄因子 bHLH93與甾醇及異戊二烯類物質的合成有關，與野生型相比，擬南芥bhlh93突變體中甾醇類物質含量顯著下降。本研究中，利用VIGS技術下調煙草中NtbHLH93基因的表達后發現，總甾醇、豆甾醇、膽固醇和β-谷甾醇的含量顯著降低。在植物質體中，萜類物質的合成通過MEP代謝途徑完成，而GGPPS基因是MEP代謝途徑中的關鍵基因。由GGPPS催化合成的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate,GGPP）與甾醇合成途徑共用兩個前體物：異戊烯基二磷酸（Isopentenyldiphosphate,IPP）和二甲烯丙基二磷酸（Dimethylallyldiphosphate,DMAPP）［22］。本研究中，通過轉錄組分析發現在pTRV2-NtbHLH93煙株中，參與MEP代謝途徑的Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g030 02.1表達量明顯升高，這兩個基因與GGPPS基因序列高度相似，推測GGPPS基因表達量的上升可能與bHLH93基因被抑制有關。此外，NtbHLH93基因表達下調后，煙草葉片發生了明顯的白化。在擬南芥中過表達bHLH93基因后，植株葉片顯著變綠，表明該基因還能影響葉綠素的生物合成［9］。

4 結論

①利用VIGS技術將煙草中已克隆到的NtbHL H93基因進行沉默，發現pTRV2-NtbHLH93煙株中NtbHLH93基因的表達量與對照植株相比平均降低了46.3%。②對pTRV2-NtbHLH93煙株中的甾醇含量進行測定，發現總甾醇、豆甾醇、膽固醇和β-谷甾醇的含量顯著降低，分別降低了17.97%、21.48%、14.02%和9.09%。③轉錄組分析發現在pTRV2-NtbHLH93煙株中，參與MEP代謝途徑的Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g0300 2.1表達量明顯升高，分別升高了2.67和2.95倍。