高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定煙葉中10種多酚類化合物

劉萍萍，盧紫舒，羅朝鵬，李澤鋒，翟 妞，鄭慶霞，盧 鵬，曹培健，周會(huì)娜，陳千思*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號(hào) 450001

多酚類化合物是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，在煙草中主要以葡萄糖苷和酯的形式存在。多酚類化合物可從植物中提取得到，具有良好的抗氧化性能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［1-5］。蕓香苷和原花青素可作為天然抗氧化劑；綠原酸具有廣泛的抗菌作用；花青素可用于食品、染料、醫(yī)藥、化妝品等方面［6］；山奈酚廣泛存在于水果、蔬菜及飲料中，具有防癌抗癌的功效；氯化飛燕草色素、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、莨菪亭、鼠李金具有一定的抗氧化功能［7-8］。研究表明，多酚類化合物對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響，同時(shí)也與烤煙的感官質(zhì)量緊密相關(guān)［9-10］。

烤煙中的多酚類化合物有多種，其中蕓香苷、綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，綠原酸占多酚類化合物總量的75%～90%［11］。其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的多酚類化合物在煙草品質(zhì)鑒定與改善方面也有輔助作用。因此，準(zhǔn)確測(cè)定煙草中多酚類化合物對(duì)于煙草鑒定、煙草制品質(zhì)量控制及卷煙設(shè)計(jì)具有重要意義［10］。煙草中成分復(fù)雜，多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，有些化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低且不易檢測(cè)［12］。因此選用合適的樣品處理和檢測(cè)方法尤為重要。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于煙葉中多酚類化合物的定性定量分析已有較多報(bào)道，主要有毛細(xì)管電泳法、分光光度法、GC法、LC法、HPLC-MS法等［13-18］。其中HPLC-MS法由于樣品處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、定性定量結(jié)果可靠、快速簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、回收率高、適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析等［19-24］，近年來(lái)已經(jīng)發(fā)展為多酚類檢測(cè)的主流方法，并已用于煙草中綠原酸、蕓香苷的定性定量分析［12］，但對(duì)于煙草中低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多酚類化合物的測(cè)定還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中基于HPLC-MS/MS技術(shù)，采用內(nèi)標(biāo)法，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)煙葉中10種多酚類化合物的方法，旨在為同時(shí)檢測(cè)煙葉中多種多酚類化合物提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

K326煙草生長(zhǎng)于25℃、16 h/8 h光暗交替條件下，收集TMV感染組和對(duì)照組的第三、第四葉位葉片，立即置于液氮中冷凍至干，-80℃保存。每組分別取3株煙草的煙葉樣品，每株為一個(gè)重復(fù)。

甲酸（質(zhì)譜純），山奈酚（Kaempferol）、花青素（Cyanidin）、氯 化 飛 燕 草 色 素（Delphinidin chloride）、鼠 李 金（Rhamnazin）、綠 原 酸（Chlorogenic acid）、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷（Delphinidin 3-O-β-glucopyranoside chloride）、原花青素B2（Procyanidine B2）、氯化花青素鼠李葡糖苷（Keracyanin chloride）、蕓香苷（Rutin）、莨菪亭（Scopoletin）、傘形花內(nèi)酯（Umbelliferone）（標(biāo)準(zhǔn)品）（美國(guó)Sigma Aldrich公司）；乙醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）。

1260/6490液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（美國(guó)Agilent公司）；BEH Phenyl色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）（美 國(guó) Waters公 司）；BSA224S-CW精密天平（感量0.000 1 g，德國(guó)Sartorius公司）；PP020XXM1超純水儀（英國(guó)Elga公司）；SPD111V真空濃縮儀（美國(guó)Thermo公司）；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5424離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

取50 mg冷凍干燥后的煙葉樣品，用研磨機(jī)研磨成粉末后，將其轉(zhuǎn)入1.5 mL（2 mL離心管）預(yù)冷的乙醇-水（4∶1，體積比）提取液中，常溫下超聲1 h；然后14 000 r/min條件下離心12 min，取1 mL上清液，將其真空濃縮成固體。用200 μL 80%乙醇（含75 ng/mL傘形花內(nèi)酯溶液）復(fù)溶，20 000 r/min離心3 min，取上清液，進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。分析條件：

色譜柱：BEH Phenyl柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸甲醇溶液（B）；洗脫梯度：0～2 min B相由5%升到15%，2～10 min B相保持15%，10.01 min～15 min B相升到100%；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。電噴霧電離源電離；正離子電離模式下毛細(xì)管電壓為4 kV；霧化氣壓力為275.6 kPa；干燥氣流量為12 L/min；干燥氣溫度為290℃；鞘氣流量為11 L/min；鞘氣溫度為200℃；采用實(shí)時(shí)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（DMRM）模式掃描。10種多酚類化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。10種化合物母離子均為M+H+峰（本研究中未考察體系中K+、Na+的影響）。

表1 10種多酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品在DMRM模式下的采集參數(shù)Tab.1 Collection parameters of ten polyphenol standard samples under DMRM mode

1.2.2 回收率測(cè)定

稱取12份相同質(zhì)量的煙葉樣品，平均分為4組。分別向4組樣品加入終濃度為0、5、15、30 μg/mL相同體積的10種多酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)液，按照上述條件進(jìn)行分析，每種化合物的分析結(jié)果值分別為C0、C5、C15、C30，分別按照公式（1）～公式（3）計(jì)算方法的加標(biāo)回收率：

終濃度5 μg/mL：

終濃度15 μg/mL：

終濃度30 μg/mL：

1.2.3 基因表達(dá)分析

RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄參照文獻(xiàn)［24］進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

在流動(dòng)相中添加少量的添加劑（如甲酸）可以增強(qiáng)質(zhì)譜離子源的離子化效率［25］。分別考察了不添加以及分別以0.05%（體積比）甲酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸和0.3%甲酸作為添加劑時(shí)的效果。以峰面積（響應(yīng)值）作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，每一濃度測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果如圖1所示，這10種多酚類化合物在0.1%甲酸時(shí)信號(hào)強(qiáng)度最好。所以選擇流動(dòng)相中添加0.1%甲酸。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

對(duì)10種多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、鼠李金、綠原酸、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、蕓香苷、莨菪亭在正離子模式下主要產(chǎn)生M+H+準(zhǔn)分子離子峰，其母子離子（m/z）分別為 287.1/152.9、288.07/213.9、303/228.9，331.1/315.9，355.11/163.1，465.1/302.8，579.2/127，595.2/286.8，611.2/302.9，193.05/132.9。 這些離子響應(yīng)值高且結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，雜質(zhì)干擾也較少，選為定量定性離子對(duì)，用于對(duì)樣品中10種多酚類化合物的定量。10種標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)如圖2所示。橫坐標(biāo)為時(shí)間（min），縱坐標(biāo)為響應(yīng)值。這10種植物多酚類化合物幾乎互不干擾，能夠得到較好的分離。

圖1 流動(dòng)相中不同濃度甲酸對(duì)10種植物多酚類化合物質(zhì)譜響應(yīng)峰面積的影響Fig.1 Effects of formic acid at different concentrations on spectral response peak areas of ten polyphenols in flowing phase

圖2 10種植物多酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖Fig.2 A flow-diagram of multiple reaction monitoring ions of ten polyphenols in mixed standard

2.2 方法的日內(nèi)日間精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

2.2.1 日內(nèi)、日間精密度

標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液中山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、鼠李金、綠原酸、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、蕓香苷、莨菪亭、傘形花內(nèi)酯的濃度分別為1.3、1.2、0.8、2.1、2.0、2.0、0.4、2.0、1.5、2.6 μg/mL。連續(xù)進(jìn)樣5 d，每天測(cè)定5次，考察其精密度。結(jié)果如表2所示，所有樣品的日內(nèi)和日間RSD均小于9%，說(shuō)明儀器狀態(tài)良好并且穩(wěn)定。相對(duì)于傳統(tǒng)的酚類物質(zhì)分析方法，本方法具有分析速度快、精密度高、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制用于離子掃描模式的系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度測(cè)定3次，將山奈酚、鼠李金、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、莨菪亭分別配成 25.00、12.50、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.19 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；花青素、氯化飛燕草色素配成 12.00、6.00、4.00、2.00、1.50、1.00、0.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；蕓香苷和綠原酸配成500.00、250.00、175.00、87.50、43.75、21.88、10.94、5.47 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每份標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)傘形花內(nèi)酯均為0.75 μg/mL。以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見(jiàn)表3?？芍?，線性擬合的R2在0.999 1～0.999 7之間。表明這10種多酚物質(zhì)在所試濃度范圍內(nèi)的響應(yīng)峰面積與其濃度具有較好的線性關(guān)系，可以用于后續(xù)樣品中多酚物質(zhì)的定量分析。同時(shí)，以信噪比3∶1計(jì)算得到的檢出限在1～200 μg/L之間，發(fā)現(xiàn)不同化合物的檢出限相差較大。

表2 測(cè)定結(jié)果的日內(nèi)RSD（n=5）和日間RSD（n=5）Tab.2 Intra-day RSDs（n=5）and inter-day RSDs（n=5）of the analytical results （%）

表3 10種植物多酚類物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.3 Linear equations,correlation coefficients（r）and limits of detection（LODs）of ten polyphenols

2.3 方法的回收率

方法的加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表4。10種多酚類化合物的加標(biāo)回收率在79.66%～112.74%之間，表明本方法的可靠性較高。

表4 10種植物多酚類化合物的加標(biāo)回收率和RSD（n=3）Tab.4 Spiked recoveries of ten polyphenols and RSD（n=3）

2.4 煙葉樣品的檢測(cè)

2.4.1 提取液的選擇

由于煙葉樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，在提取時(shí)，不同提取液的提取效率存在差異。因此需要選擇合適的提取液，以獲得較高的響應(yīng)值信號(hào)。取50 mg干煙葉樣品，然后分別用1.5 mL的50%乙醇、80%乙醇、100%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇提取液，按照1.2節(jié)的方法提取煙葉樣品中的多酚類化合物，最后均復(fù)溶到200 μL提取液中。圖3顯示了不同提取液對(duì)多酚類化合物檢測(cè)響應(yīng)的影響，橫坐標(biāo)為提取液濃度，縱坐標(biāo)為響應(yīng)值的對(duì)數(shù)值?？梢?jiàn)，除了鼠李金外，其他多酚類化合物在提取液為80%乙醇或者80%甲醇時(shí)，響應(yīng)值相對(duì)較高，且山奈酚、花青素、蕓香苷、莨菪亭等多酚類化合物在80%乙醇下的提取效率明顯好于80%甲醇。從提取效率、安全性等方面綜合考慮，選擇使用80%乙醇作為煙葉樣品多酚類化合物的提取劑。

2.4.2TMV接種煙葉的PCR測(cè)定

圖3 不同提取液對(duì)10種多酚類化合物響應(yīng)值的影響Fig.3 Effects of different extraction solvents on response values of ten polyphenols

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，在3株接種TMV病毒的煙葉上均檢測(cè)到TMV特異條帶，表明接種成功，煙葉已感病，可以用來(lái)分析TMV病毒感染對(duì)煙葉多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

2.4.3 TMV病毒感染對(duì)煙葉多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

按照建立的方法對(duì)接種過(guò)TMV的K326煙葉以及其對(duì)照組的K326煙葉葉片的10種多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣作為生物學(xué)重復(fù)，采用1.2節(jié)的方法進(jìn)行3次平行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每種多酚類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取平均值，并計(jì)算樣品間標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）；進(jìn)行T檢驗(yàn)分析（表5）。

圖4TMV特異引物對(duì)煙葉樣品PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果Fig.4 Result of electrophoresis by TMV specific primers for PCR detection of tobacco samples

表5 TMV病毒感染對(duì)煙葉中10種植物多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響①Tab.5 Effects of TMV infection on contents of ten polyphenols in tobacco leaves （μg·g-1）

由表5可以看出：感染TMV的植株極顯著（p＜0.01）增加了煙葉中山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、蕓香苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，顯著（p＜0.05）增加了煙葉中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，顯著（p＜0.05）降低了煙葉中鼠李金的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，TMV病毒感染對(duì)原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭的影響不大，差異并不顯著；TMV病毒感染極大地上調(diào)了蕓香苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在TMV感病煙葉中，蕓香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照增加了近兩倍。有文獻(xiàn)報(bào)道［21］表明CMV病毒感染的植株中總酚化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升，但未說(shuō)明具體是哪些酚類化合物上調(diào)或上調(diào)較大。本研究中TMV感染煙草葉片中的多數(shù)多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)也升高了，其總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)也明顯增加，主要以蕓香苷為主。

3 結(jié)論

①建立了利用高效液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜同時(shí)分析并定量檢測(cè)煙葉中10種多酚類化合物的方法，包括山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、鼠李金、綠原酸、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷、蕓香苷、莨菪亭，該方法的精密度良好、可靠性較高。②利用該方法分析了TMV感染對(duì)煙葉多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，山奈酚、花青素、氯化飛燕草色素、氯化飛燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷、蕓香苷在感染TMV的植株中質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升，原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭在感染TMV的植株中質(zhì)量分?jǐn)?shù)并無(wú)顯著變化，其他2種多酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)輕微的上調(diào)和下調(diào)。③本方法可用于同時(shí)分析煙葉中的多酚類化合物。