有氧運動對大鼠海馬和前額葉皮層ERK/CREB/BDNF信號通路的影響

李艷榮，蘭順領，晉 倩

（1.巢湖學院 體育學院，安徽 合肥 238000；2.廣東酒店管理職業(yè)技術學院 體育與藝術系，廣東 東莞 523900）

抑郁癥、阿爾茲海默癥（AD）、帕金森?。≒D）等多種神經(jīng)性疾病都伴有腦部萎縮，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的逐漸凋亡、神經(jīng)元細胞呈現(xiàn)退化趨勢，記憶力衰退等［1-3］.當今快節(jié)奏的社會環(huán)境中，神經(jīng)退行性疾病呈現(xiàn)年輕化趨勢、發(fā)病率逐漸升高.醫(yī)學研究表明神經(jīng)元退行性疾病患者腦組織神經(jīng)元存在可再生性［4］.

ERK/CREB/BDNF信號通路是治療神經(jīng)退行性疾病的重要途徑和作用靶點之一［5］.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，研究發(fā)現(xiàn)BDNF不僅能起到營養(yǎng)神經(jīng)的作用，而且能夠促進神經(jīng)元再生，在神經(jīng)退行性病變方面有很高的研究價值［6］.cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一種在大腦中廣泛表達的核轉錄因子，近年研究發(fā)現(xiàn)，CREB可能是應激性損傷后細胞存活的關鍵因素，具有重要的抗凋亡效應［7-8］.細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）是引起CREB磷酸化的重要激酶.有文獻報道，只有磷酸化的CREB才能激活下游基因BDNF的表達［9］.本研究通過觀察3周無負重游泳運動后大鼠海馬和前額葉皮層ERK/CREB/BDNF信號通路蛋白表達的情況，探討運動預防神經(jīng)退行性病變的機制.

1 實驗材料和方法

1.1實驗動物及分組

8周齡SPF級健康雄性SD大鼠20只，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2013-0034］，體重為 180～220 g.動物房環(huán)境溫度 25±2℃，相對濕度 50%～65%.自由進食進水、自然晝夜，自然飼養(yǎng)一周后隨機分為空白對照組（C組）和運動組（E組）兩組，10只/組.C組大鼠自然飼養(yǎng)，自由進食進水；E組大鼠進行3周無負重游泳.

1.2主要試劑

兔抗P-ERK1/2蛋白單克隆抗體：美國Abcam公司；兔抗CREB蛋白單克隆抗體：美國Abcam公司；兔抗P-CREB蛋白單克隆抗體：美國Abcam公司；兔抗BDNF蛋白多克隆抗體：美國CST公司.

1.3 運動方案

運動組在適應性喂養(yǎng)結束后進行3天適應性游泳訓練，每天10 min，之后進行正式運動干預；游泳運動方案采用3周無負重游泳，第一周采用遞增運動負荷方式，第一天20 min，第二天25 min，第三天30 min，以后每天遞增10 min，直到60 min/天.第二周、第三周6次/周，60 min/天.

1.4 組織樣本的取材

在第三周實驗結束后24 h，根據(jù)大鼠體重腹腔注射10%水合氯醛（0.35～0.4 ml/kg）進行麻醉，腹主動脈取血后斷頭取腦，清洗并分離出海馬和前額葉皮層，分別用錫紙包埋立即放入液氮中，-80℃保存，待測指標.整個取腦過程在冰面上快速進行操作，取材均由同一人完成.

1.5 組織蛋白的測定

用Western Blotting方法檢測海馬和前額葉皮層P-ERK1/2、CREB、P-CREB、BDNF的表達量.將適量組織加入組織裂解液進行勻漿、離心、濃縮、蛋白定量后，在沸水中煮8 min使蛋白質變性.用BCA法測定蛋白濃度，與加樣緩沖液混勻，加樣25 ul，進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜，將轉移好的PVDF膜放入10%脫脂奶粉封閉液中封閉 2 h，PBST 洗膜 5次，每次 5 min.加 P-ERK1/2抗體（1∶1 000）、CREB 抗體（1∶2 000）、P-CREB 抗體（1∶1 000）、BDNF 抗體（1∶1 000）孵育過夜，PBST 洗膜 5 次，每次 5 min.加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）孵育1 h，PBST洗膜5次，每次5 min.應用ECL熒光底物混合液浸泡PVDF膜，室溫孵育3～5 min后，用濾紙擦干，于暗室曝光，膠片顯影、定影.

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結果均用平均數(shù)±標準差（Xˉ±S）表示，組間比較采用獨立樣本T檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有非常顯著性.

2 實驗結果

2.1 兩組大鼠海馬相關蛋白的表達

與 C 組相比，E組大鼠海馬 P-ERK1/2、CREB、P-CREB、BDNF蛋白表達量均明顯增加（P＜0.01）.其中P-ERK1/2約平均升高1.5倍，CREB約平均升高1.7倍，P-CREB約平均升高2.3倍，BDNF約平均升高3.4倍（見圖1及表1）.

圖1 兩組大鼠海馬信號通路蛋白的表達

表1 兩組大鼠海馬信號通路相關蛋白的相對表達（±S）

表1 兩組大鼠海馬信號通路相關蛋白的相對表達（±S）

注：與 C 組相比，*代表 P＜0.05 ，**代表 P＜0.01，下同.

指標 P-ERK/GAPDH C 1.37±0.02 E 2.07±0.06**CREB/GAPDH 1.30±0.10 2.20±0.11**P-CREB/GAPDH 0.31±0.02 0.73±0.04**BDNF/GAPDH 0.33±0.04 1.12±0.07**

2.2 兩組大鼠前額葉皮層相關蛋白的表達

與C組相比，E組大鼠前額葉皮層P-ERK1/2、CREB、P-CREB、BDNF蛋白表達量均明顯增加（P＜0.01）.其中P-ERK1/2約平均升高1.5倍，CREB約平均升高1.6倍，P-CREB約平均升高4.1倍，BDNF約平均升高4倍（見圖2及表2）.

圖2 兩組大鼠前額葉皮層信號通路蛋白的表達

表2 兩組大鼠前額葉皮層信號通路相關蛋白的相對表達（±S）

表2 兩組大鼠前額葉皮層信號通路相關蛋白的相對表達（±S）

指標 P-ERK/GAPDH C 2.06±0.06 E 3.06±0.08**CREB/GAPDH 1.56±0.07 2.44±0.09**P-CREB/GAPDH 0.21±0.02 0.87±0.03**BDNF/GAPDH 0.29±0.02 1.18±0.06**

3 分析討論

ERK1/2是MAPKs家族中的重要成員，在未受到細胞刺激時，ERK1/2分布在胞質中，被激活磷酸化后則進入細胞核調節(jié)CREB等核轉錄因子的活性，發(fā)揮細胞調節(jié)作用；未進入核內(nèi)活化的ERK停留在胞漿，可磷酸化細胞骨架蛋白，調節(jié)細胞形態(tài)及骨架的重分布［10］.

大量研究發(fā)現(xiàn)ERK是海馬樹突結構形成所必需的，與學習記憶功能密切相關.CREB參與神經(jīng)元的再生過程，記憶訓練活動可以促進CREB的激活，增加P-CREB基因的表達，這種現(xiàn)象在大腦皮質和海馬區(qū)均有發(fā)生［11］.通過手術切斷雙側海馬傘或者向大鼠海馬內(nèi)注入CREB的反義寡核苷酸，然后對大鼠進行學習記憶行為的訓練，大鼠逃避行為減弱、記憶力衰退，這種現(xiàn)象伴隨海馬P-CREB表達的下降［12］.

Roberson等用ERK拮抗劑作用于海馬CA1區(qū)血小板凝集抑制劑激活的CREB，最終P-CREB表達量顯著下降［13］.被激活的CREB可以促進BDNF和其受體TrkB的表達，注入CREB的反義寡核苷酸可以抑制BDNF的上調［14］.研究發(fā)現(xiàn)，BDNF的作用不僅是營養(yǎng)保護神經(jīng)元，還參與神經(jīng)損傷后的再生過程［15］.李小龍研究表明，4周單純有氧運動可以非常顯著性的上調P-ERK的表達，而總蛋白表達量沒有差異［16］.這說明有氧運動是通過上調P-ERK的表達，起到了預防Aβ引起的海馬炎癥反應的作用，而不是通過ERK蛋白本身.趙燕研究表明，每天自主跑輪運動1 h，連續(xù)進行8周，可以非常顯著性的促進大鼠海馬P-ERK的表達［17］.Shen等報道一次自愿跑輪運動可以增加大鼠海馬P-CREB的表達，并發(fā)現(xiàn)CREB與BDNF基因CRE序列的結合增加，促進BDNF基因的轉錄，這次運動的效果可以持續(xù)一周［18］.Vaynman等發(fā)現(xiàn)一周自愿運動不但可促進CREB的磷酸化水平，而且發(fā)現(xiàn)CREB mRNA基因表達增加［19］.MJChen發(fā)現(xiàn)，2周的跑輪運動訓練后P-CREB的水平升高約60倍，如果配合抗抑郁藥物的使用，甚至可升高90倍［20］.長時間運動可以提高BDNF的表達，BDNF的高表達有抗抑郁、提高應變能力的效果，還可以延緩由衰老引起的認知功能的退化.

4結語

研究結果顯示3周游泳運動可以增加大鼠海馬和前額葉皮層神經(jīng)元ERK/CREB/BDNF信號通路蛋白的表達，增強神經(jīng)元的可塑性，從而保護神經(jīng)元免受損傷、參與神經(jīng)元損傷后修復，有氧運動對皮層ERK/CREB/BDNF信號通路相關蛋白表達的促進作用強于海馬.