HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊改善家兔通便效果實驗研究

周佰慧，王珍婷，宋霞宇，韓德權

（黑龍江大學生命科學學院·黑龍江省高校微生物重點實驗室·教育部農業微生物工程中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

目前，便秘的主要治療方法為藥物治療[1]，常見的潤滑性瀉藥包括液體石蠟、開塞露等長期使用會干擾維生素的吸收，患者使用更痛苦[2]；刺激性瀉藥，如番瀉葉和大黃等，起效快，但長期使用會削弱結腸動力[3]，易引起依賴性和繼發性便秘[4]。便秘的發生與腸道微生物菌群失衡[5]，微生態制劑治療已成為當前研究的熱點[6]。雙歧桿菌在維持腸道菌群平衡中扮演重要的角色，且已被證實可調節人體腸道菌群平衡[7-8]、提高免疫力[9]及改善便秘等[10]。目前，常見的雙歧桿菌制劑主要是硬膠囊、片劑等，難以確保藥物在儲存期間的穩定性，且由于其不耐胃酸和膽鹽，難以確保在到達腸后仍存在大量活菌[11]。因此，本研究中開發了一種具有結腸溶性的青春雙歧桿菌軟膠囊，是以大豆油為載體[12]，將HD青春雙歧桿菌混懸其中，制成軟膠囊并對其膠囊殼進行處理使其具有一定的結腸溶性[13]。本研究中從腸道菌群、排便功能和生理體征3個方面探討了HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊對便秘家兔緩解便秘的影響，旨在為其臨床應用提供有效的實驗依據[14]。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：PurifiationEquipment潔凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；3.5L厭氧產氣包（海博生物技術有限公司）；DHG-914型電熱恒溫鼓風干燥箱、DNP-9082型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；H-1650型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀有限公司）；MVS-1型漩渦混合器（北京金北德工貿有限公司）；BCD-118TMPA型冰箱（海爾集團）；LDZM-75型立式蒸汽壓力滅菌器（上海申安醫療器械廠）；ME203E型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；ZB-1E型智能崩解儀（天津市天大天發科技有限公司）。

試藥：鹽酸洛哌丁胺（西安楊森制藥有限公司，批號為20150917）；HD結腸溶性雙歧桿菌軟膠囊（黑龍江大學生命科學院204實驗室，批號為20151013，規格為0.1 g含1×108cfu）；雙歧桿菌活菌膠囊（麗珠集團麗珠制藥廠，批號為 20150607，規格為 0.35g含 1 ×108cfu）。

動物：雄性健康家兔，SPF級，體質量1500～2000 g。飼養條件為室內溫度（23±1）℃，相對濕度40% ～55%。在每天12 h光照和12 h黑暗處理后，在喂食兔配方飼料后7 d開始實驗。

2 方法與結果

2.1 結腸溶性軟膠囊制備（甲醛浸漬法）

體外崩解時間確定：將軟膠囊浸入錐形瓶中，甲醛體積分數分別為5%，8%，10%，12%，14%，浸漬時間分別為0.5，1.0，2.0 h。取出浸泡過的軟膠囊，用無水乙醇洗滌多次，直至甲醛氣味消失。

結果見圖 1。在不同體積分數的甲醛溶液中浸泡0.5 h，后崩解時間小于300 min，表明軟膠囊在到達結腸時就已崩解，不能達到結腸溶性膠囊的工藝要求。5%及8%的甲醛溶液浸泡1.0 h及2.0 h后，膠囊崩解時間都無法達到結腸溶性要求。浸泡在10%的甲醛溶液，膠囊的崩解時間超過300 min，可滿足結腸溶性條件。考慮到應盡量減少甲醛殘留，故選擇10%甲醛溶液處理軟膠囊。

圖1 甲醛浸泡0.5，1.0，2.0 h的軟膠囊崩解時間變化

結腸溶性基準判斷：取浸泡后的軟膠囊，每次6粒，放入崩解儀器中。在人工胃液中崩解2 h，用少量蒸餾水沖洗，置人工腸液中崩解3 h，取出，放入人造結腸液中進行崩解，記錄最終的崩解時間。如軟膠囊到達結腸溶液并崩解，則證明其符合結腸溶性要求。

2.2 便秘家兔造模及處理

造模：選取16只健康家兔并稱重。隨機選取4只家兔作為空白對照組，給予生理鹽水；其他12只家兔被用作便秘組，每天2 mL鹽酸洛哌丁胺生理鹽水（按4.0 mg／kg體質量將鹽酸洛哌丁胺溶于2 mL生理鹽水）灌胃，連續灌胃4 d制作便秘模型[15]。判斷模型是否成功的依據有家兔食物攝入量、飲水量、體質量增加，排便次數和糞便含水量5個指標。與空白對照組相比，如果上述指標均顯著下降，則證明造模成功。

糞便形態觀察：每天定期觀察家兔糞便，描述不同時期家兔糞便、便秘的癥狀[16]。記錄24 h內的飲水量、采食量、體質量變化和糞便顆粒數。每天收集的糞便立即稱重，以防止水分流失并導致實驗錯誤。然后將糞便在80℃下干燥8 h至恒重。稱量糞便的質量并計算含水量，按含水量／%=（m1-m2）／m1×100%[17]，m1為糞便鮮重（g），m2為糞便干重（g）。結果見圖 2。A 組正常，家兔糞便呈球形，大小相似，整齊，但模型組糞便形狀不齊整，較小，可能為便秘引起。

正常組和造模組指標比較：由表1可知，便秘組家兔食物攝入量和水攝入量顯著減少，因此導致體質量增加較慢。提示便秘家兔由于便秘導致食欲不振和生長緩慢。此外，便秘組家兔的排便數量和糞便含水量也顯著低于空白對照組，證明便秘造模組的家兔排便不暢，并伴有糞便干結等癥狀，可判斷造模成功。

圖2 造模后家兔糞便外觀對比

表1 空白對照組和便秘造模組指標比較（± s，n=4）

表1 空白對照組和便秘造模組指標比較（± s，n=4）

注：與空白對照組相比，*P ＜0.05，#P ＜0.01。

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2.3 喂食家兔效果試驗

家兔分組及處理：將造模成功的12只家兔分為模型對照組（B組）、陽性對照組（C組）和HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊組（D組），空白對照組（A組）和B組喂食正常，其余2組分別給予雙歧桿菌活菌膠囊和HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊，膠囊中含有相同數量的雙歧桿菌數（均為 1×108cfu）。

糞便形態：由圖3可見，D組家兔的糞便在7 d后大小相似并且形狀均勻，幾乎與正常兔無法區分，便秘癥狀消失；C組喂飼后糞便的形態、大小接近正常，但存在一些條帶，便秘癥狀并未完全消失。表明雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊對便秘的療效更好。

圖3 給藥后家兔糞便外觀比較

采食量、水攝入量、體質量增加量：結果見表 2。D組家兔食物攝入量和攝水量均顯著高于B組，與A組無顯著差異（P＞0.05）；與C組相比，D組食物攝入量顯著增加，但水攝入量無明顯差異（P＞0.05）；與A組相比，D組體質量增加量無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊可顯著改善便秘家兔的食物攝入和水攝入量，不會阻礙家兔的生長，因此與正常家兔無明顯差異。

排便粒數和糞便含水量：結果見表 2。與B組相比，C組和D組糞便粒數顯著增加，D組與A組糞便粒數無顯著性差異（P＞0.05）。但與A組相比，C組無顯著增加排便量，且未恢復到正常排便狀態。D組便秘兔的糞便粒數和含水量明顯增加，具有明顯的改善便秘作用。

表2 4組家兔觀察指標比較（± s，n=4）

表2 4組家兔觀察指標比較（± s，n=4）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＞0.05。圖4同。

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2.4 家兔腸道菌群變化試驗

采集實驗第1天、建模后第5天和給藥后的第7天的家兔新鮮糞便4～6粒。用無菌鑷子挑取新鮮糞便0.1 g，加入0.9 mL生理鹽水中，漩渦振蕩1 min。進行10倍系列梯度稀釋，每次選擇10-2到10-5的稀釋度，分別接種于 TPY，LBS，PS，EMB，YEPD 培養基上，培養48～72 h后，計算糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、酵母菌及消化球菌的活菌數（cfu／g）[18]。

結果見圖 4。造模前所有家兔的腸道菌群無明顯差異，腸道菌群正常，可以開始實驗。造模后，除A組外，各組家兔腸道菌群中大腸桿菌和酵母菌增多，雙歧桿菌、乳酸桿菌和消化球菌均顯著減少（P＜0.05），表明便秘家兔腸道菌群紊亂，有害菌增加，有益菌減少。給藥7 d后，與B組相比，D組乳酸桿菌和消化球菌顯著增加，大腸桿菌、酵母菌顯著減少。結果表明，HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊能調節便秘家兔腸道菌群平衡。在C組家兔腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌和消化球菌的數量增加，但差異不顯著（P＞0.05），大腸桿菌數量減少。因此，HD雙歧桿菌結腸軟膠囊對治療便秘和調節兔腸道菌群平衡具有顯著作用。

3 討論

本研究中，D組在給予受試藥品7 d后與B組比較，便秘家兔的糞便粒數顯著增加，糞便含水量提高，說明HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊具有潤腸通便作用，可增強家兔的腸道蠕動能力，促進腸道內積累的糞便排出，因而能緩解家兔便秘癥狀。對家兔糞便中菌群進行細致分析，與B組相比，D組家兔腸道內大腸桿菌數量明顯減少，這可能是由于雙歧桿菌代謝產生的大量有機酸等物質可促進腸道蠕動、增加腸管內的滲透壓、分泌水分，從而產生通便效果[19]。與C組相比，HD雙歧桿菌可更有效地增加家兔腸道中乳酸桿菌，雙歧桿菌和消化道球菌的數量，并減少大腸桿菌的數量。同是雙歧桿菌膠囊，HD雙歧桿菌腸溶軟膠囊效果優于陽性對照藥的原因主要有2個方面：所用雙歧菌體活性高于雙歧桿菌活菌膠囊；HD雙歧桿菌腸溶軟膠囊中具有大豆油載體，可起到物理潤腸作用。

圖4 4組家兔腸道菌群比較

采用家兔主要是考慮喂飼方便，實際上與人應用活菌制劑的情況仍有一定差異。所用的HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊的結腸溶性是仿照人的代謝時間對囊殼進行處理而得到的，對家兔是否具有結腸溶性不得而知，還需測定其糞便中的脂肪含量，再綜合各項指標，以便為HD雙歧桿菌結腸溶性軟膠囊改善便秘的機理研究提供實驗依據。