3種中藥口服液體制劑抑菌效力測定與評價*

曹寒梅 ，楊曉莉 ，蔡 虎 ，常 春 ，傅 強 △

（1.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061； 2.陜西浩瀚管理技術咨詢有限公司，陜西 西安 710065； 3.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065； 4.陜西省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗院，陜西 咸陽 712046）

中藥口服液體制劑（如合劑、糖漿劑、酒劑等）多含動植物成分，蛋白質和糖分含量高，且原材料中攜帶大量微生物，產品在生產、貯藏和使用過程中易受微生物污染，甚至發(fā)生霉變，故應確認藥物的抗菌活性。如藥品本身抑菌效力不足，應根據制劑特性添加適宜的抑菌劑，以防止?jié)撛诘奈⑸镂廴綶1-5]。抑菌劑（也稱防腐劑）是一類防止或限制微生物生長與繁殖的化學藥品，其主要作用是保證藥劑質量，防止藥劑尤其是多劑量包裝制劑的微生物污染[6]。銀翹解毒合劑、止咳枇杷合劑、參術止帶糖漿均為多劑量口服制劑，使用過程中會多次打開包裝，有被污染的風險，其處方中需添加抑菌劑，因抑菌劑有毒，故添加量應為最低有效量[7]。目前，國內對中藥制劑抑菌效力的研究較少。本研究中考察了上述3種口服液體制劑的抑菌效力是否符合衛(wèi)生安全。現(xiàn)報道如下。

1 儀器、材料與試藥

儀器：LDZX-80KCS型壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；HFsafe-1800TEⅡ，B2型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱；MJ 250FI型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Densi CHEK Plus比濁儀（美國生物梅里埃公司）。

培養(yǎng)基及稀釋液：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均由北京三藥科技開發(fā)公司提供，培養(yǎng)基適用性檢查符合2015年版《中國藥典》要求。

菌種：細菌，包括金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10104〕和大腸埃希菌〔CMCC（B）44102〕；真菌，包括白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕和黑曲霉〔CMCC（F）98003〕。上述 5 種標準菌株均購自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株為第2代。

試藥：銀翹解毒合劑（樣品A為每瓶100 mL，抑菌劑為山梨酸，含量為0.1%）；止咳枇杷合劑（樣品B為每瓶120 mL，抑菌劑為苯甲酸鈉，含量為0.26%）；參術止帶糖漿（樣品C為每瓶210 mL，抑菌劑為苯甲酸鈉，含量為0.30%）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18 h；接種白色念珠菌于SDB液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24 h；用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋并制成試驗所需濃度的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d或直至獲得豐富的孢子，加入3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液置無菌試管內；用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，并制成試驗所需濃度的菌懸液。

2.2 方法學考察

供試液制備：取各樣品10 mL，分別加入90 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，45℃恒溫振蕩15 min，制成 1∶10（V∶V）的供試液。

計數方法適用性試驗：取5種供試液，分裝于5個無菌試管中，每管裝量9.9mL，再分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.1 mL。用0.1 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同法制備供試品對照組，以及不加樣品的菌液對照組。分別吸取試驗組、供試品對照組、菌液對照組液體各1 mL，置直徑90 mm的無菌平皿中，平行2份，細菌注入約20 mL溫度不超過45℃融化的TSA培養(yǎng)基，搖勻，凝固后置35℃倒置培養(yǎng)2～3 d；真菌注入約20 mL不超過45℃融化的SDA培養(yǎng)基，搖勻，凝固后置25℃倒置培養(yǎng) 3～5 d。

計數方法適用性試驗回收率：試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值計算回收率，結果見表 1。各試驗菌的回收率均在0.8～1.0范圍內，符合要求，說明抑菌效力試驗中的微生物存活菌落數的測試可采用平皿法（1∶10，1 mL）進行。

表1 計數方法適用性回收試驗結果

2.3 抑菌效力測試[8-10]

2.3.1 樣品制備

菌懸液：首先制備濃度較高、干擾較少的菌懸液。取2.2項下制備好的新鮮液體培養(yǎng)物銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌，離心收集菌體，采用比濁法制成每1 mL含菌數約為108cfu的菌懸液。取多份含有豐富孢子的黑曲霉瓊脂培養(yǎng)物，2.1項下方法制成每1 mL含孢子數約為108cfu的孢子懸液。

供試品：3種樣品均含有少量沉淀，且原包裝裝量較滿，開啟后密封性不好，加入菌液不易混勻，故選在無菌瓶中試驗。每種樣品各取3瓶，在500 mL無菌瓶中混合均勻后，無菌條件下取20 mL置無菌玻璃瓶中，按目標菌的個數平行制備5瓶，每瓶接種制備好的5種菌懸液各0.2mL（接種菌懸液的體積不得超過供試品體積的1%），使1 mL供試品接種菌量為105～106cfu，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布。

2.3.2 初始加菌量計數

在上述“供試品”項下試驗的同時，分別吸取1 mL供試品，置直徑90 mm的無菌平皿中，平行2份，按2.2項下方法操作及培養(yǎng)，得1 mL供試品中各試驗菌初始加菌量。

2.3.3 試驗方法及結果

將2.3.1項下含菌液供試品置25℃培養(yǎng)箱中避光貯存，依據2015年版《中國藥典（四部）》通則1121“抑菌效力檢查法”項下抑菌效力評價標準表，培養(yǎng)14 d和28 d時，分別取供試品各1 mL，通過梯度稀釋測定每份所含菌落數，測定細菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌用沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。根據存活菌數測定結果，計算1 mL供試品各試驗菌所加的菌落數及各間隔時間的菌落數。結果見表 2。

表2 抑菌效力試驗結果

2015年版《中國藥典（四部）》對口服液體制劑抑菌效力判斷標準要求，培養(yǎng)14 d時，細菌lg值減少3，真菌lg值減少1；培養(yǎng)28 d時，細菌、真菌未增加（與14 d比較，試驗菌增加數量的lg值不超過0.5）。將上述試驗結果與判斷標準進行比較，3種樣品對細菌的抑制結果與接菌量比較，培養(yǎng)14 d及28 d菌落數lg值下降均大于4.6，說明該3種樣品對細菌的抑制能力較強，符合要求。3種樣品對真菌的抑制結果與接種菌量比較，培養(yǎng)14 d時的lg值下降均大于1.8，培養(yǎng)28 d菌落數也呈下降趨勢，未增加。可看出藥物對真菌的抑制作用不如細菌，有少量真菌存在，但依然滿足要求。3種樣品抑菌劑系統(tǒng)有效，能保證藥品不易受微生物污染，安全有效，建議在處方中對防腐劑的最小有效量或對種類另作考察，以確保該藥在使用過程中安全、有效。

3 討論

藥品在使用和保存過程中有可能被空氣中的微生物污染，進而產生安全隱患。抑菌劑是藥物制劑中常見的一種附加劑，企業(yè)在開發(fā)階段都必須確認藥品中抑菌劑的抑菌效力。近年來，國產制劑抑菌劑濫用問題越來越受關注。2010年版《中國藥典》首次收載了抑菌效力檢查法，制定了控制標準和檢測方法，2015年版《中國藥典》對抑菌效力檢查法做了很大調整。現(xiàn)有文獻主要著眼于眼用制劑抑菌劑抑菌效力的檢查[8-9]，其他劑型抑菌效力檢測方法的探討目前較少[10]。本研究中依據藥典方法對3種中藥口服液體制劑進行了加菌試驗，比較試驗菌在樣品中的存活率，以探討樣品的抑菌效力，對生產企業(yè)研發(fā)階段抑菌濃度的確定有一定參考價值[11]。