人CD8+T細胞基因調控網絡研究

韓鵬勇，塔 娜，寶魯日，于海泉

(內蒙古大學，省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特 010070)

免疫系統在病毒感染、腫瘤免疫應答等方面有重要作用。Dunn等[3]發現免疫系統對腫瘤存在免疫編輯現象，而免疫逃逸是所有癌癥類型的主要特征之一，腫瘤細胞通過招募正常免疫細胞形成腫瘤微環境，影響腫瘤的發生和發展。Reiser等[4]發現免疫系統中的na?ve CD8+T細胞在急性感染時，分化成效應細胞，在病原體清除后以記憶細胞形式長期儲存。在慢性感染或腫瘤中，CD8+T細胞變為“功能異常狀態”的表型。但腫瘤微環境影響腫瘤浸潤性免疫細胞，使其喪失識別和攻擊腫瘤細胞的能力，具體作用機制有待深入研究。基因調控網絡在細胞分裂、分化、癌變、死亡等生理過程中起關鍵作用[5]。Corces 等[6]建立一種靠轉座酶插入到染色體開放區域結合高通量測序的 ATAC-seq 技術，轉錄因子在該開放區域的不同位點結合控制下游基因的表達和關閉[8]，結合轉錄因子和染色體開放區域數據可以繪制特定細胞類型的基因調控網絡[9]。通過分析基因調控網絡鑒定在特定生物過程中的基因、關鍵調控因子和局部亞網絡[10]，從而揭示癌癥特性及癌癥病人愈后相關的分子機制和信號調控網絡[11]。

Cayuela等[2]發現黑色素瘤占據所有皮膚癌致死率的80%，是危害人類健康的主要癌癥之一,目前在其免疫治療中,免疫檢查點抑制劑(抗PD1和抗CTLA4)通過阻斷T細胞表面抑制性受體而擴增免疫應答，引起腫瘤細胞的抗腫瘤效應。本試驗通過已有ATAC-seq技術研究人黑色素腫瘤浸潤性CD8+T細胞數據，構建基因調控網絡、轉錄因子調控網絡及細胞表面受體調控網絡并進行比較分析，為系統鑒定復雜生理過程中的基因研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 ATAC-seq數據

來自黑色素瘤病人血液中的 na?ve CD8+T(HN)、效應記憶CD8+T(HEM)、中央記憶細胞CD8+T(HCM)，黑色素瘤浸潤性功能異常CD8+T[(PD1)數據ID為GSE89308]，來自GEO數據庫[12]。

1.2 注釋峰文件

通過HOMER軟件注釋峰文件，得到注釋的基因，選取轉錄起始位點2 kb作為匹配序列[8,13]。

1.3 制作調控網絡

采用MEME軟件的FIMO(Find individual motif occurrences)模塊匹配DNA結合基序的轉錄因子，將峰的匹配序列與MEME的結合基序數據庫進行比對(P<1×10-4)[14]。通過Linux腳本程序鑒定轉錄因子與其調控的基因，構建基因調控網絡、轉錄因子調控網絡、細胞表面受體調控網絡，并通過編程尋找每種細胞特異的基因、轉錄因子和細胞表面受體。

1.4 網絡可視化及基因通路富集分析

采用Cytoscape對差異調控網絡進行可視化分析[15]，通過Enrichr對差異基因進行信號通路富集分析[16-17]。

2 結果與分析

2.1 基因調控網絡構建與比較

通過對3種正常CD8+T類型HCM、 HEM、 HN 和功能異常CD8+T細胞(PD1)的峰文件用HOMER軟件注釋，選擇轉錄起始位點上下2 kb的bed文件，用FIMO 和Bedtools軟件生成的fasta文件進行比對，構建每種細胞的基因調控網絡。結果顯示HCM 和HEM注釋的基因14 084 個， HN注釋的基因10 397個，PD1注釋的基因14 015個。這 4 種細胞含有10 298個相同基因，如圖1所示，與PD1處理細胞相比，HEM和HCM含有69個特異的基因，HN有99個，功能異常CD8+T細胞、HEM和HCM比HN細胞多3 717個基因(圖1)。

圖1 HCM、HEM、HN、PD1細胞基因調控網絡比較Fig.1 Comparison of gene regulatory network in HCM，HEM,HN,PD1

每種細胞特異基因通過Enrichr網站信號通路富集分析(表1)，HN 特異基因富集的信號通路有凋亡與組織穩態相關DNA 片段化通路、顆粒酶 A介導細胞凋亡、蛋白水解、 Notch信號通路、GATA3參與活化 Th2 細胞因子的活化通路等；HEM和HCM特異基因富集的信號通路有Ras通路、Erk PI3K通路、整合素信號通路等。功能異常CD8+T細胞(PD1)特異的信號通路有BRCA1、BRCA2和ATR介導的癌癥易感性通路、端粒酶RNAhTERC基因的轉錄調控通路，雌激素響應蛋白Efp控制的細胞周期等信號通路。

2.2 轉錄因子調控網絡構建與比較分析

以3 種正常CD8+T細胞亞型和功能異常CD8+T細胞(PD1)分別構建轉錄因子調控網并進行比較分析，HCM和HEM含有475個相同的轉錄因子，HN含有 365 個，而功能異常CD8+T細胞(PD1)含有 474 個(圖2)。與功能異常CD8+T細胞(PD1)相比 ，3 種正常CD8+T細胞亞型中GBEB2轉錄因子表達關閉，功能異常CD8+T細胞(PD1)、HCM和HEM細胞比HN細胞多 58 個轉錄因子。

對差異表達轉錄因子和基因潛在的調控關系進行分析(圖3)，發現HEM和HCM細胞中GMEB2轉錄因子分別調控KCNQ2和RALGDS，HN細胞GMEB2轉錄因子分別調控KCNQ2、RALGDS和TBCD。與HN細胞相比，功能異常CD8+T細胞(PD1)增加的ZFX轉錄因子調控51個基因，3 種正常CD8+T細胞中GMEB2轉錄因子調控KCNQ2和RALGDSPD1，而功能異常細胞中隨著GMEB2轉錄因子的丟失，其調控的基因也丟失，而ZFX轉錄因子和其調控的相應基因同時被激活。

表1 3 種正常CD8+ T亞型和腫瘤浸潤性CD8+ T細胞差異基因信號通路富集分析Table 1 Comparison of differential gene pathway enrichments in 3 CD+8 subtypes and tumor infiltrating CD8+T cells

圖2 HCM、HEM、HN、PD1細胞基因調控網絡比較Fig.2 Comparison of gene regulatory network in HCM,HEM,HN,PD1

2.3 細胞表面受體調控網絡比較分析

從每種細胞基因調控網絡提取細胞表面受體，制作相應細胞的表面受體調控網絡并進行比較分析(表2)，發現HCM和HEM含有細胞表面受體493個，HN有377個，功能異常CD8+T細胞(PD1)有492個。與功能異常CD8+T細胞(PD1)進行對比，HCM、HEM存在特異的細胞表面受體CD7，HN存在CD7和P4HB。與HCM和HEM相比，PD1沒有特殊的細胞表面受體；與HN相比，HCM、HEM和PD1細胞增加117個細胞表面受體。

增加的117個細胞表面受體中，HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-F、HLA-F-AS1、HLA-G為MHCI相關基因，MMP15、MMP2、MMP25為基質金屬蛋白酶基因，參與炎癥反應，Fas誘導凋亡，Fas配體參與抗腫瘤效應。對這些特異的受體進行信號通路富集分析，如表3所示，富集的有TCR激活、IL2介導T細胞激活、IL4信號通路、抗原處理與呈遞信號通路等，表明HN細胞在受到抗原刺激后，激活T細胞識別和攻擊腫瘤的能力。

圖3 HEM、HCM、HN、PD1細胞差異轉錄因子調控網絡Fig.3 Differential regulatory networks in HEM,HCM,HN and PD1

細胞類型Cell type和HN相比增加的表面受體Increased cellular receptors in PD1,HEM,HCM in contrast to HNPD1、HEM、HCMACTN2、ADAM17、ADIPOQ、AGGF1、BGN、BST2、C1QBP、C3AR1、C9、CALM3、CALR、CCR10、CD151、CD163、CD1D、CD3G、CD4、CD63、CD70、CD8B、CHID1、CLEC2D、CLU、COL1A1、CP、CTGF、CXCL5、DAG1、DLL4、DSC1、DSCAML1、EMC7、EMILIN1、EPHB1、ESF1、F11R、F2R、FAS、FCGR3A、GCG、GP9、GUCY2D、HGFAC、HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-F、HLA-F-AS1、HLA-G、ICAM1、ICAM3、IFITM3、IGF2、IGFBP4、IGFBP6、IL12A、IL12A-AS1、IL15RA、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL6、IL6ST、INHBC、ITGA1、ITGA5、ITGAD、ITGB3、ITGB7、ITIH2、ITM2B、JAG2、KIDINS220、LAMB1、LGALS3BP、LMAN2、LPA、LSR、MASP2、MERTK、MET、MFGE8、MMP15、MMP2、MMP25、MS4A1、OSTC、PDGFRB、PILRA、PLXNA1、PPIA、PPT1、PRAF2、PRSS3、PTGDR、PT-PRF、S100A4、S100B、SCARF1、SEMA4C、SFN、SLC30A5、SLC4A2、SLC7A11、SLC9A1、SORT1、SPINT2、ST14、TLR4、TMEM256-PLSCR3、TMEM9、TNFRSF4、TNFSF4、VASN、VCAN-AS1、YIF1A

表3 PD1、HEM、HCM比HN細胞增加細胞表面受體富集的信號通路Table 3 Cellular surface receptors pathway enrichment in PD，HEM，HCM contrast to HN

3 討論與結論

3.1 4 種細胞的基因調控網絡比較分析

對 4 種細胞的基因調控網絡比較分析發現，每種細胞有特異的基因，通過對特異基因進行基因通路富集分析發現，HN 特異的信號通路有凋亡與組織穩態DNA片段化通路，顆粒酶 A介導的細胞凋亡，蛋白水解和 Notch通路，GATA3 參與活化 Th2 細胞因子活化通路，Calcineurin角質細胞分化通路。HEM和HCM基因調控網絡類似，存在特異的調控網絡有Ras通路，Erk and PI-3k激酶通路，整合素信號通路，血管內皮離子通道等。功能異常CD8+T細胞(PD1)特異的信號通路有BRCA1、BRCA2 和ATR介導的癌癥敏感性通路，端粒酶RNA成份hTERC基因的轉錄調控通路，AKAP95在有絲分裂和染色體動力學相關作用通路， PI3K參與的細胞周期通路，雌激素響應蛋白Efp控制的細胞周期和細胞周期素等通路。研究發現3 種正常CD8+T細胞亞型特異基因富集的信號通路有Ras等正常CD8+T細胞功能相應通路，而功能異常CD8+T細胞(PD1)特異表達的基因參與細胞周期、端粒酶等相關信號通路。

3.2 4 種細胞的轉錄因子調控網絡分析

本研究通過對 4 種細胞的轉錄因子調控網絡分析發現，和功能異常CD8+T細胞(PD1)相比，na?ve CD8+T細胞(HN)增加58個轉錄因子；和HN、HEM、HCM 3種正常CD8+T細胞亞型相比，功能異常CD8+T細胞(PD1)丟失轉錄因子 GMEB2。在HEM 和HCM細胞的轉錄因子調控網絡中，GMEB2轉錄因子分別調控KCNQ2和RALGDS，在HN細胞中GMEB2轉錄因子調控KCNQ2、RALGDS和TBCD。Xiong[25]和Johnson 等[26]發現KCNQ2和RALGDS參與炎癥反應，TBCD參與禽H5N1等病毒感染[24]。PD1細胞比HN細胞增加的ZFX轉錄因子調控1 714個基因。表明丟失的轉錄因子和特異的基因之間存在相互調控關系。GMEB2是KDWD基因家族成員，基因表達產物會和GMEB1相互作用，參與小病毒DNA復制，如凋亡等糖皮質激素基因相關作用。Kawabe等[25]研究表明IL-12在參與炎癥和免疫應答中，通過PI3K/AKt信號通路上調GMEB1/2的表達，會促進T細胞抗凋亡作用。Arakawa等[26]發現GMEB2表達降低會減弱T細胞的抗凋亡功能，該基因是抗炎癥反應的重要組成部分。

3.3 4 種細胞的細胞表面受體調控網絡分析

對 4 種細胞的細胞表面受體調控網絡分析發現，和功能異常CD8+T細胞(PD1)相比，HCM、HEM細胞含有特殊的細胞表面受體CD7，HN細胞有CD7和P4HB。與HCM、HEM細胞相比，PD1無特異的細胞表面受體；與HN細胞相比，HCM、HEM和PD1細胞增加117 個細胞表面受體，與PD1細胞相比，HN增加58 個轉錄因子存在相互調控關系，其中ZFX轉錄因子調控51 個細胞表面受體。Garin等[27]發現Galectin-1 (LGALS1) 在調節性T細胞(Treg)中表達選擇性升高，結合到T細胞表面受體CD7上。Pace等[28]研究發現T細胞CD7表達上調會引起LGALS1促T細胞凋亡信號。Bi等[29]發現P4HB是一種結合Galectin-9 的蛋白。LGALS1和Galectin-9相互作用會促進T細胞凋亡。CD7和P4HB的表達下降，可下調T細胞的凋亡水平，可能導致T細胞增殖異常，向功能異常狀態轉變。Philip等[30]發現部分PD1高表達的細胞CD38和CD101高表達，CD5低表達是功能異常T細胞的細胞標記物。Pauken等[31]發現PD1阻斷治療在一定程度上恢復部分功能異常T細胞的表觀變化。王濤等[32]發現CD7的一個配體SECTM1在很多腫瘤中都表達。CD7在T細胞和NK細胞中特異表達，表達會活化T細胞。表明CD7和P4HB表達下調會誘導T細胞向功能異常狀態轉變。

抗病育種從分子標記輔助育種逐漸發展到依靠基因組選擇育種[21]，但由于一些性狀的復雜會限制分子育種的應用。基因組選擇育種是基于分子標記，編輯造成某些特定性狀的基因[33]。在新西蘭、澳大利亞、英國采用SNP芯片在牛羊上進行輔助育種，存在缺乏合適的表型監控、種群小、花費高等問題[34]。本文通過調控網絡研究發現人CD8+T細胞通過轉錄因子GMEB2表達關閉，ZFX轉錄因子開啟，細胞表面受體CD7 和P4HB表達關閉，關閉正常CD8+T細胞參與的信號通路基因，激活相應基因，轉變為一種功能異常狀態。在病毒感染和腫瘤中CD8+T細胞都發生功能異常，通過調控網絡找到引起功能異常狀態關鍵的基因、轉錄因子、細胞表面受體；通過基因工程等手段提高特異基因的水平，提高動物免疫系統CD8+T細胞在疾病中免疫應答，為抗病育種尋找特定基因提供理論基礎及新思路。