Bt蛋白對楊扇舟蛾連續世代存活與發育的影響

王留成，劉 潔，高佳敏，孟丹陽，姚 彤，孫天驊，高寶嘉

(河北農業大學 林學院，河北保定 071000)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種普遍存在的桿狀芽孢桿菌，自1996年美國首次將轉Bt殺蟲蛋白基因作物商業化以來，在世界范圍內迅速用作許多害蟲的防范措施[1]，Bt生物農藥和轉Bt基因作物大大提高了人們有效安全地管理農業害蟲的能力，但是由于受Bt毒素強烈的時間和空間選擇壓力，多種鱗翅目害蟲已經產生抗性[2-3]，昆蟲對Bt的抗性已經成為轉基因作物最主要的生態風險，也是Bt作物持續長期有效的最大威脅[4-5]。

在全球范圍內，已有大約17種昆蟲在實驗室中對Bt產生抗性，1種在田間表現出廣泛的抗性，8個國家進行77項研究得出結論，由于更廣泛的監測、Bt作物種植面積的增加以及暴露于Bt作物的害蟲種群數量和累積暴露時間的上升，到2010年，13種主要害蟲中有5種與Bt作物的田間進化抗性有關，其中有4種是毛蟲，而2005年只有1種與Bt作物有關[6]。國內近年來也有諸多相關報道，如梁革梅等[7]通過室內篩選棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)16代后對轉Bt基因棉的抗性上升43.3倍；楊峰山等[8]研究表明，小菜蛾(Plutellaxylostell)的Bt抗性品系在繁殖能力上存在顯著的生存劣勢；而陳建[9]以含Bt飼料飼養甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)后認為，低濃度Bt對幼蟲存活、生長發育和繁殖均未造成影響，甚至對成蟲生殖有一定的促進作用；賀明霞等[10]也發現亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)在不斷提高的汰選壓下其種群對Cry1Ie毒素的敏感性逐漸下降。這些昆蟲與轉基因作物的交互抗性研究為今后合理實施害蟲抗性治理策略提供了重要依據。

在林業中昆蟲與Bt交互抗性的研究主要是通過鱗翅目害蟲的短期脅迫反應來評價轉基因楊的抗蟲性，如康薇[11]分析‘中嘉8號’轉Bt基因楊的田間抗性及生物安全性，鄭均寶等[12]、張炬紅等[13]及王智等[14]分析轉雙抗蟲基因‘741’楊(BtCry1Ac+API)的抗蟲性，均表明轉基因楊對靶標害蟲具有良好的抗蟲性。但劉軍俠等[15]與宋曉英[16]基于SSR分析發現楊扇舟蛾(Closteraanachoreta)實驗種群取食轉基因楊后其遺傳多樣性有明顯增高趨勢，這些研究對轉基因楊的可持續利用具有重要意義。而楊扇舟蛾是危害楊樹生長期的主要食葉害蟲，其1a可發生4～5代，產卵量大，蟲口數量易在短期劇增，可將整株楊樹的樹葉吃光，在中國華北、東北及西北地區都有不同程度的蟲災發生[17-18]，嚴重危害當地森林資源和生態安全。因此林業害蟲在Bt脅迫下其連續世代生長發育的變化同樣值得探討。本試驗以楊扇舟蛾為例，連續3代對其飼喂轉基因‘Pb29’楊葉片及浸泡Cry1Ac殺蟲蛋白原毒素的楊樹葉片，明確Bt對楊扇舟蛾的長期殺蟲活性與控制效果，發現昆蟲對Bt的抗性產生規律和機制，為Bt的長期有效性、防止或延緩Bt抗性昆蟲種群的發展提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與蟲源

非轉基因毛白楊無性系‘741’楊[Populusalba×(P.davidiana+P.simonii)]×P.tomentosa選自河北農業大學標本園；轉基因‘741’楊高抗品系‘Pb29’為田穎川[19-20]、鄭鈞寶等[12]培育的轉雙抗蟲基因[Bt殺蟲蛋白基因(BtCry1Ac)+慈菇蛋白酶抑制基因(API)]無性系，選自河北農業大學標本園。采摘枝條中部的健康、新鮮葉片飼喂幼蟲。

供試楊扇舟蛾幼蟲及卵塊采自河北省保定市郊區非轉基因楊人工純林，由于野采幼蟲部分有寄生蜂寄生及雜菌感染，因此在養蟲室用對照741楊樹葉片培養F1代至羽化，隨機交配產F2代孵化成幼蟲，正常葉片飼養，3齡后用于試驗。

所用BtCry1Ac原毒素購于北京美延農業科技有限公司，試驗期間避免強烈陽光直射。

1.2 樣品處理及昆蟲飼養

‘741’楊和轉基因‘Pb29’楊葉片處理前用蒸餾水清洗晾干。將BtCry1Ac原毒素以50 mmol/L的Na2CO3溶液稀釋，配成系列質量濃度，依次為A=15 μg/mL、B=7.5 μg/mL、C= 1.5 μg/mL，現配現用。將新鮮干凈的‘741’楊葉片在各梯度藥液中浸泡10 s后保鮮自然晾干；‘Pb29’楊葉片不做處理，設為P組，經檢測其Bt表達量低于C組；以50 mmol/L Na2CO3溶液作為對照組(CK)。各處理葉片用花泥保濕，移入高為12.0 cm，直徑為8.5 cm的罐頭瓶中。

所有楊扇舟蛾均于養蟲室內飼養，條件： 26 ℃±1 ℃，相對濕度60%～75%，光周期 16L∶8D。將生長狀態一致的3齡幼蟲接到葉片上，250目紗網封口，每處理接幼蟲20頭，3次重復，每天更換新鮮的處理后的楊樹葉。各處理Bt脅迫6 d后全部飼喂正常的非轉基因‘741’楊樹葉片，視幼蟲數量適時分瓶，直至幼蟲老熟化蛹，羽化后各組分別轉入直徑28 cm、高32 cm、120目尼龍網的養蟲籠中，并以稀釋100倍的蜂蜜水供其取食，自由交配產卵。相同方法連續飼養3代，記錄幼蟲的死亡率、發育歷期、化蛹率，蛹質量及成蟲的羽化率。

1.3 數據統計與分析

數據以“平均值±標準誤(SE)”表示，處理間不同參數(百分率指標以反正弦處理)經方差齊性檢驗一致且服從正態分布，并采用SNK檢驗法進行差異顯著性分析；回歸分析采用線性回歸；蛹質量數據采用重復測量的方差分析法進行代間比較，經箱式圖檢驗無異常值，經Shapiro-Wilk檢驗服從正態分布(P>0.05)，經Mauchly’s球形假設檢驗，因變量的方差協方差矩陣相等(P> 0.05)，不相等的(P<0.05)通過Greenhouse-Geisser方法校正。數據均以SPSS 19.0計算所得，以Office Excel 2016為輔助工具。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度Cry1Ac對楊扇舟蛾連續世代存活的影響

2.1.1 幼蟲8 d死亡率 幼蟲取食含Bt樹葉 6 d后，Bt在隨后兩天里仍會發揮作用，故統計幼蟲的8 d死亡率表明，第1代各處理下Bt對楊扇舟蛾的短期致死效果存在顯著差異(P<0.05)，死亡率隨著葉片中Cry1Ac質量濃度的升高而顯著升高(P<0.05)(表1)，其中A組的死亡率達 83.4%，顯著高于C組的低質量濃度處理(P< 0.05)；第2代差異性與第1代類似，A、B、C組的死亡率比第1代均有下降，雖然C組仍然比CK高，但已無顯著性差異(P>0.05)；第3代中A組死亡率與前兩代相比下降明顯，且B組、C組及P組與CK之間差異不顯著(P>0.05)，可見Bt對楊扇舟蛾連續世代的短期致死效果出現減弱的趨勢。

2.1.2 楊扇舟蛾每代存活率 楊扇舟蛾幼蟲的存活曲線表明，幼蟲取食含Bt樹葉后1～2 d內并沒有出現明顯的死亡現象(圖1)，這是由于楊扇舟蛾幼蟲體內的BtCry1Ac毒蛋白與中腸受體結合，毒蛋白插入膜內形成孔洞需要一定的響應時間，至幼蟲死亡則需要2～3 d。從第4天開始各處理均出現死亡現象，且在停止Bt脅迫后的9～13 d內幼蟲仍受到其影響，各組存活率不斷下降，其中第1代及第2代與對照組差異顯著(P<0.05)，P組存活率在B組與C組之間，第13天后各組逐漸趨于穩定；從幼蟲化蛹前的校正存活率來看(表2)，A組高濃度Bt處理對連續3代楊扇舟蛾幼蟲的長期抑制效果沒有出現明顯減弱，但隨著世代的延續其他各組存活率開始升高，且各處理間差異在逐漸縮小(圖1-b,1-c)，養蟲試驗中發現，10～17 d死亡的幼蟲大部分發育遲緩，無法蛻皮，齡期長期停留在3齡，并且從3代存活曲線的平臺期越來越明顯可以看出，這部分幼蟲取食正常葉片仍不能完成整個生命歷程，但幼蟲的死亡速度逐漸減緩，對Bt的耐受性在逐漸增強，其中B組最為明顯，到第3代存活率為 86.7%，與對照相當。

表1 不同質量濃度Cry1Ac飼養楊扇舟蛾 3代的8天幼蟲死亡率Table 1 Mortality of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin 8 days for three generations

注：同列中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Values within a column followed by different letters are significantly different(P<0.05).The same below.

a.第1代 The first generation；b.第2代 The second generation；c.第3代 The third generation

2.2 不同質量濃度Cry1Ac對連續世代楊扇舟蛾發育歷期的影響

楊扇舟蛾連續世代各齡期變化表明(表3)，初孵幼蟲在無Bt脅迫下齡期均為4 d左右，且每代差異均不顯著(P>0.05)；通過1～3代的3齡發育時間對比，3齡中期開始脅迫后隨著質量濃度升高各組齡期也隨之明顯延長，且每代的A組均與其他處理差異顯著(P<0.05)，A組第1代有的幼蟲處于3齡期長達23 d，而第2、3代低質量濃度處理的部分幼蟲已經在停止Bt脅迫末期能蛻皮到達4齡；從高齡期數據可以看出，第1代各處理四齡均比對照長，Bt對幼蟲發育及蛻皮速度影響明顯，但第2、3代高齡幼蟲已基本與對照無顯著差異(P>0.05)；各世代對比表明，雖然每代齡期比上代有所縮短，但相同處理的每代間發育時間差異不顯著(P>0.05)。

整個幼蟲歷期的統計結果表明(圖2)，3種質量濃度的BtCry1Ac及轉基因‘Pb29’楊均使楊扇舟蛾幼蟲的發育速度顯著減慢，歷期延長(P< 0.05)，其中對照組的發育歷期最短，第1代 15.12 d、第2代14.51 d、第3代12.73 d，且每代發育速度比前一代有少量加快；A組各代歷期分別為29.19、27.13、29.33 d，較對照分別延長 14.07、12.62、16.44 d，從表3可知主要是由于幼蟲長期停留在3齡所致；P組所喂葉片Bt質量濃度雖然比C組低，但第1、2代歷期反而比C組長；B組各代歷期為24.47、21.87、14.42 d，第3代有較大縮短，C組每代歷期也均有縮短(24.47、21.87、19.52 d)，但B組第3代與對照無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同質量濃度Cry1Ac飼養楊扇舟蛾幼蟲 3代的校正存活率Table 2 Corrected survival rate of Clostera anachoreta larvae after they were dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin for three generations

注：校正存活率=(處理存活率-對照存活率)/(1-對照存活率)×100%。

Note:Corrected survival rate=(Treatment survival rate-Control survival rate)/(1-Control survival rate)×100%.

2.3 不同質量濃度Cry1Ac對連續3代楊扇舟蛾蛹質量的影響

由圖3可知，Bt脅迫下第1代幼蟲的蛹質量受到嚴重影響，其隨著Cry1Ac殺蟲蛋白質量濃度的升高而出現明顯減輕，對照組的蛹渾圓飽滿，A組與B組的蛹細小瘦弱，僅有100多 mg，C組與P組較對照也有極大減輕。通過重復測量方差分析法所得結果如下。

A組3代蛹質量分別為(134.57±12.17) mg、(207.76±11.61) mg和(220.28±18.56) mg，各代蛹質量差異具有統計學意義，F(2,4)=28.861，P= 0.004，偏η2=0.935，第2代蛹質量比第1代顯著升高73.190 mg(95%置信區間：29.373～117.007，P=0.018)，第3代與第2代(P=1.000)、第3代與第1代(P=0.051)差異不顯著。

B組分別為(138.57±13.56) mg、(234.14± 9.53) mg和(403.88±48.73) mg，差異具有統計學意義，F(2,4)=72.962，P=0.001，偏η2= 0.973，第2代蛹質量比第1代顯著升高95.567 mg(95%置信區間：38.206～152.927，P= 0.018)，第3代比第1代顯著升高265.310 mg(95%置信區間：38.802～491.818，P=0.037)，第3代與第2代(P=0.056)差異不顯著。

C組分別為(163.33±15.54) mg、(251.98± 15.55) mg和(294.40±31.98) mg，差異具有統計學意義，F(2,4)=37.302，P=0.003，偏η2= 0.949，第2代蛹質量比第1代顯著升高88.650 mg(95%置信區間：42.597～134.703，P= 0.014)，第3代比第1代顯著升高131.073 mg(95%置信區間：14.155～247.992，P=0.040)，第3代與第2代(P=0.550)差異不顯著。

表3 不同質量濃度Cry1Ac飼養楊扇舟蛾3代的齡期Table 3 Instar of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin for three generations

P組分別為(176.99±16.51) mg、(269.63± 10.53) mg和(315.11±62.86) mg，差異具有統計學意義，F(2,4)=13.456，P=0.017，偏η2= 0.871，第2代蛹質量比第1代顯著升高92.633 mg(95%置信區間：60.920～124.347，P= 0.006)，第3代與第2代(P=0.960)、第3代與第1代(P=0.144)差異不顯著。

CK組分別為(248.06±8.14) mg、(287.90± 12.99) mg和(400.53±32.34) mg，差異具有統計學意義，F(2,4)=34.347，P=0.003，偏η2= 0.945，但第2代與第1代(P=0.217)、第3代與第2代(P=0.125)、第3代與第1代(P=0.051)差異均不顯著。

把世代設為x，各處理平均蛹質量設為y后(圖3)，其線性回歸方程分別為：

A：y=42.853x+101.83，R2=0.856 9

B：y=132.65x-6.444 6，R2=0.974 6

C：y=65.537x+105.5，R2=0.960 2

P：y=69.06x+115.79，R2=0.962 6

CK：y=76.235x+159.69，R2=0.929 4

圖中所列數據為平均值±標準差，不同字母表示相同處理的不同世代之間差異顯著(P<0.05，SNK法檢驗)。下同 The data shown in the figure are average±standard deviation.Different letters indicate significant differences among different generations of the same treatment(P<0.05,SNK test).The same below

圖2 楊扇舟蛾幼蟲連續取食Cry1Ac葉片的3代幼蟲歷期
Fig.2 Laval duration of three successive generationsofClosteraanachoretalarvae dietingwith the leaves of Cry1Ac

可見各組蛹質量隨著世代延續均有升高趨勢且差異具有統計學意義(P<0.05)，其中A、B、C、P組的第2代比第1代顯著升高(P<0.05)，但第3代比第2代均無顯著性差異(P>0.05)，且CK組各世代間均無差異性(P>0.05)，推測世代對蛹質量的影響在逐漸減弱；回歸分析發現處理與對照間的差距在不斷縮小，A組增幅最小，Bt連續3代對其化蛹均有較強的抑制效果；而B組中質量濃度處理增幅反而最高，從亞致死劑量的B組存活下來的高齡老熟幼蟲有著比CK還要強的營養積累能力；低質量濃度C組的蛹質量反而低于B組和P組。以上表明即使Cry1Ac對幼蟲前期有較大影響，停止脅迫后存活并發育到高齡期的幼蟲仍然能夠攝取到足夠的營養完成化蛹，且隨著世代的延續蛹質量也在不斷增加，但不同梯度處理間并沒有線性差異。

圖3 不同質量濃度Cry1Ac飼養下 楊扇舟蛾的蛹質量Fig.3 Pupal mass of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin

2.4 不同質量濃度Cry1Ac對連續3代楊扇舟蛾化蛹率及羽化率的影響

盡管幼蟲化蛹率隨葉片中Cry1Ac殺蟲蛋白質量濃度的升高而下降，由于轉移至正常葉片上存活下來的高齡幼蟲大部分均能發育至蛹，而處理組幼蟲死亡導致化蛹基數有一定減少，所以化蛹率與死亡率趨勢及差異性相似(表4)；羽化率的計算以最終成蛹量為基數，即羽化的楊扇舟蛾數占蛹數的比例，各世代間羽化率隨Cry1Ac質量濃度的升高有輕微波動，處理較對照及世代間無顯著差異(P>0.05)。表明即使Cry1Ac殺蟲蛋白對3齡楊扇舟蛾幼蟲脅迫后，其各代幼蟲化蛹之后的羽化過程仍不受影響。

表4 不同質量濃度Cry1Ac連續飼養楊扇 舟蛾3代化蛹率及羽化率的影響Table 4 Pupation and emergence of three successive generations of Clostera anachoreta larvae dieting with different mass concentrations of Cry1Ac toxin

3 討 論

3.1 楊扇舟蛾對Bt的抗性風險

通過分析不同質量濃度Bt Cry1Ac脅迫對楊扇舟蛾連續3代存活率、發育歷期以及蛹質量等指標的影響，結果表明，含Bt Cry1Ac殺蟲蛋白的葉片及轉基因‘Pb29’楊對3齡楊扇舟蛾有著較強的毒殺作用，高質量濃度Bt對低齡幼蟲的致死效果隨著代數延長沒有明顯減弱，與高寶嘉等[21]的研究一致，也有報道楊扇舟蛾幼蟲取食轉基因‘741’楊兩代未產生抗性，且連續兩代脅迫后第2代死亡率高于第1代[13,22]，由此推測楊扇舟蛾初孵幼蟲很難在轉基因楊上完成世代發育。本研究幼蟲取食Bt葉片后發育受到抑制，第1代和第2代幼蟲歷期較對照組明顯延長，陳建[9]與張炬紅等[13]也有相似的研究結論，但停止脅迫后高齡幼蟲齡期基本不受影響，且死亡率降低，耐受性逐漸提高，因此如果取食非轉基因楊的高齡幼蟲轉移到Bt楊上取食后就有可能存活下來。

蛹質量隨Cry1Ac質量濃度的升高而顯著下降，同鐘勇等[23]研究結果相似，但本試驗中蛹質量隨著世代延長而穩定回升，在亞致死劑量存活下來的老熟幼蟲比低質量濃度處理幼蟲有著更強的耐受性，營養積累能力增強，可見低濃度的Bt處理無法激發幼蟲的響應機制，反而在亞致死劑量脅迫下幼蟲會產生較明顯的適應性。結合上文分析及本試驗中較高的羽化率結果，由于轉基因楊樹對楊扇舟蛾實驗種群深刻的遺傳分化影響[15-16]，野外楊扇舟蛾種群在不同寄主間取食與繁殖的世代延續過程中，可能會產生對轉Bt基因楊樹產生抗性的楊扇舟蛾種群。

此外，本試驗所用‘Pb29’楊中轉了Bt和API兩種抗蟲基因，雖然其表達的Bt質量濃度低于1.5 μg/mL，但由于存在API基因，增強了抗蟲效果，進而影響取食‘Pb29’楊葉片的幼蟲齡期與發育歷期。而致死效果不穩定可能是由于采取的多年生轉基因‘Pb29’楊葉片中Bt表達量不穩定所致。另外處理組歷期縮短除了對Bt的適應性逐漸加強的因素，也有可能還受野生楊扇舟蛾在室內連續飼養逐漸馴化及季節氣候變化的 影響。

3.2 多種高效管理策略的必要性

植物與昆蟲之間是不斷相互選擇、協同進化的[24]。害蟲取食植物過程中，植物能夠產生多種次生性代謝產物影響害蟲的取食行為或生理反應來抵御害蟲侵害，害蟲又能通過改變體內酶的響應機制等多種途徑不斷地適應寄主植物的抗蟲性[25]，甚至食物中可溶性蛋白質-可消化碳水化合物的含量都可以降低對Bt毒素的敏感性[26]，因此實施有效和高效的管理策略來控制蟲害爆發是非常具有挑戰性的，因為它依賴于對害蟲生物學和生態學的全面了解，以及預測加劇害蟲管理問題的變化趨勢[27]。為了延緩和管理田間害蟲對Bt作物的抗性，世界范圍內應用較為廣泛的有金字塔植物策略(在同一植物中表達不同的Cry基因)及高劑量/避難所策略，而自然避難所策略適用于具有高成蟲擴散行為的多食性害蟲，對單食性或低分散性害蟲不適用[28]，而本研究中楊扇舟蛾對亞致死劑量的高度耐受性也證明世代種群對轉Bt植物抗性累積發展的風險，因此在林業中開展種群動態監測、金字塔植物及避難所策略等措施，從而防止或延緩Bt抗性昆蟲種群的產生。

4 結 論

楊扇舟蛾在不同質量濃度Bt Cry1Ac及轉基因‘Pb29’楊脅迫下連續3代的發育指標表明，含Bt Cry1Ac殺蟲蛋白的葉片及轉基因‘Pb29’楊對3齡楊扇舟蛾有著較強的毒殺作用，幼蟲取食Bt葉片后發育受到抑制，但隨世代延長對低質量濃度Bt及轉基因‘Pb29’楊耐受性逐漸提高，且老熟幼蟲齡期不受影響；蛹質量隨Cry1Ac質量濃度升高顯著下降，但隨著世代延長而穩定回升，而在亞致死劑量存活下來的老熟幼蟲比低質量濃度處理幼蟲有更明顯的適應性，增加楊扇舟蛾對轉Bt基因楊樹的抗性風險。