續隨子 ElDGAT1基因的克隆、序列分析及表達特性

孫超超，葛麗萍,，任國鵬，李潤植

(1. 山西農業大學 林學院，山西太谷 030801；2. 山西農業大學 分子農業與生物能源研究所， 山西太谷 030801；3. 北方功能油料樹種培育與研發山西省重點實驗室，山西太谷 030801)

續隨子(EuphorbialathyrisL.)又名千金子、菩薩豆、小巴豆等，屬大戟科大戟屬的1a生或2a生草本植物[1-2]，原產于歐洲[3]。續隨子種子含油量較高，油脂質量分數約為45%～60%，主要成分包括棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)、亞麻酸(18∶3)等，其中油酸(18∶1)質量分數可高達總油脂的84%以上。油酸作為不飽和脂肪酸，有利于人體消化吸收、軟化血管、防止血栓形成等作用[4]，還可以降低人體血液中膽固醇質量分數，降低動脈硬化發生的概率[5]。相關研究表明，續隨子種子油脂與理想柴油替代品C19H36O2的分子組成類似[6-7]，是一種經濟利用價值較高的生物質能材料[8]，因此，續隨子也被譽為“石油植物”。而目前關于續隨子種子油脂代謝的研究甚少，其油脂生物合成及調控機制的研究也未見報道。

植物油脂主要以三酰甘油(Triacylglycerol，TAG)的形式貯藏在種子中，三酰甘油的合成是由細胞內一系列的酶促反應完成的，其中二酰甘油酰基轉移酶1(Diacylglycerol acyltransferase，DGAT1)是催化植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反應的關鍵酶和限速酶[9-10]，它催化酰基-CoA鏈上的脂酰基轉移到sn-1,2-二酰甘油(DAG)分子的sn-3碳原子上生成三羧酸甘油酯[11]。已有研究表明，DGAT1能夠提高種子含油量，而對該酶的研究被認為是提高油脂質量分數的最佳途徑[12-16]。例如，在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)中超表達旱金蓮(TropaeolummajusL.)的TmDGAT1可使擬南芥種子油質量分數提高3.5%[12]；在油菜(BrassicanapusL.)種子中超表達油菜的BnDGAT1可使種子含油量提高14%[13]；Zheng等[14]發現過表達高油玉米(ZeamaysL.)DGAT1基因可使玉米種子含油量、油酸質量分數分別提高24.9%和84.5%。目前，煙草[15]、油菜[13]、蓖麻[16]等油料植物的DGAT1基因相繼被克隆研究，而針對續隨子ElDGAT1基因的克隆及功能分析尚未見報道。

本試驗依托續隨子轉錄組數據，從續隨子種子中克隆獲得ElDGAT1基因，利用生物信息學方法分析ElDGAT1蛋白的序列特征，并運用實時熒光定量技術研究該基因在不同器官中的表達特性，為進一步研究ElDGAT1基因的功能及續隨子種子油脂的生物合成積累機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用續隨子種植于山西農業大學林學院苗圃，分別取根、莖、葉、花及種子發育的3個不同時期S1(開花后15 d)、S2(開花后30 d)、S3(開花后45 d)，液氮速凍后，于-80 ℃保存備用。

1.2 方 法

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 ElDGAT1蛋白的基本結構及系統發育分析ElDGAT1基因編碼的氨基酸序列和開放閱讀框(ORF)運用在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析；ElDGAT1蛋白的基本理化性質借助ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析軟件；跨膜區和信號肽的分析分別采用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測；利用NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對ElDGAT1蛋白的功能結構域進行分析；ElDGAT1蛋白二級結構以及三維結構建模分別利用SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進行預測；運用MEGA 7.0多序列比對軟件構建續隨子及其他物種DGAT1蛋白序列的系統進化樹，并根據同源性來預測ElDGAT1蛋白的功能。

2 結果與分析

2.1 ElDGAT1基因克隆

使用高保真酶對續隨子S3時期種子cDNA進行RT-PCR擴增，擴增產物電泳分離結果顯示(圖1)：獲得長度為1 530 bp的目的條帶，割膠回收目的片段純化并測序，后續將測序結果與轉錄組數據進行比對分析。

M.DL2000 Marker；1.ElDGAT1基因擴增產物ElDGAT1gene amplification product

圖1ElDGAT1基因PCR擴增產物電泳結果
Fig.1 Electrophoresis of amplified PCRproduct ofElDGAT1gene

2.2 ElDGAT1蛋白的基本結構及系統發育分析

通過對ElDGAT1基因開放閱讀框分析可知(圖2)：ElDGAT1基因全長為2 376 bp，編碼區長1 530 bp，共編碼509個氨基酸。預測ElDGAT1基因編碼蛋白的理化性質，其化學分子式為C2675H4121N691O702S31，分子質量為58.19 ku，等電點pI為8.89，不穩定系數為51.25，脂溶系數為101.67，親水性系數為0.284，推測ElDGAT1蛋白為疏水性膜結合蛋白。跨膜區和信號肽預測存在9個典型的跨膜螺旋區，不存在信號肽；亞細胞定位預測該蛋白結合在內質網上。

NCBI-CDD在線預測ElDGAT1蛋白的功能結構域，圖3表明：ElDGAT1蛋白在第61～506位氨基酸具有特定匹配的結構域PLN02401(diacylglycerol acyltransferase)，屬于MBOAT膜蛋白家族(MBOAT superfamily)，該家族含有多種酰基轉移酶，具有特定的酰基轉移功能，據此預測ElDGAT1蛋白同樣具有酰基轉移功能。

PLN02401.二酰甘油酰基轉移酶特定匹配的結構域 Diacylglycerol acyltransferase specific hits；MBOAT superfamily.膜結合O-酰基轉移酶超家族 Membrane bound O-acyl transferase

圖3 ElDGAT1蛋白質功能結構域分析
Fig.3 Analysis of the domain of ElDGAT1 protein

運用SPOMA對ElDGAT1蛋白的二級結構進行預測可知：ElDGAT1蛋白由α-螺旋 (47.74%)、β-轉角(3.73%)、延伸鏈(11.00%)和無規則卷曲(37.52%)4種結構元件組成。使用SWISS-MODEL預測ElDGAT1蛋白的三級結構(圖4-a)，其三級結構與模板6bug.1膜蛋白的晶體結構(圖4-b)相似度為18.92%，它包含D-丙氨酸載體蛋白(D-alanyl carrier protein)和D-丙氨酰轉運蛋白DltB(D-alanyl transfer protein DltB)，且屬于膜結合的O-酰基轉移酶超家族(MBOATs)，這與NCBI-CDD對ElDGAT1蛋白的功能結構域預測結果相符，據此推測ElDGAT1蛋白具備二酰甘油酰基轉移酶功能區，即有酰基轉移功能。

利用MEGA7.0軟件對續隨子及烏桕(Triadicasebifera)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、油桐(Verniciafordii)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)等DGAT1的蛋白序列進行比對分析，構建系統發育樹，為更加真實地反映植物DGAT1蛋白的系統發育過程，本研究以拉曼被孢霉的DGAT蛋白作為外類群。結果顯示(圖5)：續隨子與同為大戟科的蓖麻、麻瘋樹、油桐、烏桕、橡膠樹及木薯這6種同科植物被聚在同一個分支中。而在這個分支中，續隨子與烏桕親緣關系最近，構成了一個小分支，同源性高達86%。此外，續隨子與橡膠樹和木薯的同源性 次之。

2.3 ElDGAT1基因在不同器官中的表達特性

由圖6可知，ElDGAT1基因在續隨子的根、莖、葉、花及種子中均有表達，但在不同器官中的表達量有所差異。ElDGAT1基因在種子中的表達量相對較高，其種子的S1、S2、S3 3個時期的表達量呈逐漸升高趨勢；根系和葉中的表達量低于其他器官，且根中表達量最低；而在莖和花中的表達量略低于S1時期。

3 討 論

續隨子是一種開發前景廣闊的新型能源油料作物[19]，且其脂肪酸組分與理想柴油替代品的分子組成相似，是中國生物燃油發展的理想原料[20-21]。研究表明，DGAT是植物油脂合成途徑中催化三酰甘油合成的關鍵酶，對于調控種子油脂合成發揮著重要作用[22]。

本試驗分離鑒定續隨子ElDGAT1基因，并獲得了續隨子中編碼ElDGAT1基因的全長cDNA序列。ElDGAT1基因cDNA序列全長2 376 bp，CDS序列長1 530 bp，共編碼509個氨基酸。預測ElDGAT1蛋白定位于內質網上，為疏水性膜結合蛋白，不存在信號肽，含有9個典型的跨膜螺旋區，具有PLN02401結構域，屬于MBOAT蛋白超家族，這與前人在玉米[14]、煙草[15]、大豆[23]等植物中DGAT1的分析結果相似。ElDGAT1蛋白二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主，其中 α-螺旋最多，占47.74%；其三維結構與模板6bug.1膜蛋白的晶體結構相似度為 18.92%，且該模板有2個蛋白結合位點，具備二酰甘油酰基轉移酶功能區，進一步表明該蛋白有酰基轉移功能。基于DGAT1蛋白的系統發育分析顯示：續隨子與同科植物烏桕的親緣關系最近，同源性高達86%，與橡膠樹和木薯的同源性次之，而這4種植物同屬于大戟科，即系統發育分析結果和傳統分類劃分相吻合，表明不同植物間蛋白同源性分析可為進一步分析其親緣關系提供一定的參考。

圖5 ElDGAT1與不同物種DGAT1蛋白的系統進化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ElDGAT1 and other DGAT1 proteins from different species

小寫字母表示在0.05水平方差分析的差異顯著性 Lowercase letters indicates significant difference at 0.05 level

圖6 不同器官中ElDGAT1基因表達特性分析
Fig.6 Relative expression level ofElDGAT1gene in different organs

續隨子ElDGAT1基因在種子發育的3個時期上調表達，表明ElDGAT1基因在續隨子積累油脂的種子中，隨著種子的發育ElDGAT1基因的表達量也逐漸升高，這與本課題組元博[24]近年來對續隨子生長發育旺盛時期其種子油脂積累特性的研究結果相符。qPCR檢測顯示：ElDGAT1基因在續隨子不同器官中均有表達，且在種子中表達量最高，遠高于葉片。另有研究表明，在油料作物種子發育階段，油脂積累速率與DGAT表達情況之間存在明顯的正相關性[10]。例如，同科植物蓖麻RcDGAT1的研究表明，在蓖麻種子油脂積累的高峰期，隨著RcDGAT1活性增強，種子油脂質量分數也顯著增加[25]。在大部分高等植物中，DGAT1與種子發芽、幼苗發育以及TAG合成等過程均有密切關系，并且在植株的各器官中均表達，其表達情況有明顯差異。例如，同科植物蓖麻RcDGAT1在各器官中均有表達，而旱金蓮TmDGAT1只在發育的種子中表達[12]。另外，DGAT1基因在許多雙子葉植物，如大豆、油菜等在植株中的表達情況與模式植物擬南芥相似[26-28]，擬南芥AtDGAT1在種子萌發、幼嫩的花芽和花瓣中表達量明顯高于葉和莖[26]，這與續隨子ElDGAT1基因在莖和花中的表達量明顯高于根和葉片，在種子不同生長發育時期表達量呈遞增趨勢有所不同，這表明ElDGAT1基因在續隨子中有其獨特的表達特性。目前，煙草[15]、油菜[16]、大豆[23]、蓖麻[25]等植物的DGAT1均已被克隆研究，并對其功能做了相關驗證。本研究對續隨子的ElDGAT1基因也成功克隆，但對其功能的驗證還需后續更深入的研究。

4 結 論

本試驗通過克隆獲得了續隨子ElDGAT1基因，并運用生物信息學方法系統分析了該基因的理化性質，利用qPCR技術研究ElDGAT1基因在續隨子不同器官中的表達譜。結果表明：ElDGAT1基因ORF為 1 530 bp，編碼509個氨基酸。預測其編碼的蛋白定位于內質網上，且含有9個典型的跨膜螺旋區，具有酰基轉移酶的功能。另外，續隨子積累油脂的種子中ElDGAT1基因表達量高于其他器官，而且隨著種子的發育表達量升高。本試驗研究了續隨子中ElDGAT1基因在油脂合成積累過程中的表達特性，為ElDGAT1基因的功能鑒定以及后續續隨子中調控油脂合成高表達基因的轉化應用提供依據。